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Microfluidizer® Technology for Cell Disruption |
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(출처: Microfluidics Application Note) |
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Introduction
세포 파쇄 방법에 따라 파쇄 효율뿐만 아니라 파쇄물의 입자 크기, 점도 및 단백질 회수율 등 물리·화학적 특성이 달라진다.
따라서 적절한 세포 파쇄 방법을 선택하는 것은 최종 산물의 품질과 후속 공정에 중요한 영향을 미친다.
본 Application Note 에서는 주요 세포 파쇄 기술을 비교하고, Microfluidizer® processor 가 세포 파쇄 효율뿐만 아니라 수율, 점도 및 분리성 측면에서 갖는 장점을 소개한다. |
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Commonly used technologies in the lab
실험실에서는 다양한 세포 파쇄 방법이 사용되지만, 각 기술은 시료 규모, 재현성, 온도 제어 및 후속 공정 측면에서 한계를 가진다.
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French Press : 높은 압력을 이용해 세포를 파쇄하지만 재현성과 확장성이 낮고, 세척과 밸브 조작이 번거롭다. |
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High Pressure Homogenizer (HPH) : 대용량 처리에 적합한 방법이지만 냉각, 세척, 밸브 마모 및 Scale-up 과정에서 문제가 발생할 수 있다. |
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Ultrasonication : 소량 시료에 적합하지만 국부적인 온도 상승, 수율 및 Scale-up 에 한계가 있다. |
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Freeze-thawing : 간단한 방법이지만 재현성이 낮고 매우 소량의 시료에 적합하다. |
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Chemical Lysis : 세포벽을 화학적으로 파괴하지만 화학물질에 의한 오염과 비용 문제가 발생할 수 있다. |
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Mortar and Pestle : 수작업 방식으로 재현성과 확장성이 낮다. |
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Media Milling : 효과적인 세포 파쇄가 가능하지만 Media 에 의한 오염과 온도 제어가 문제가 될 수 있다. |
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Enzyme pre-treatment : 세포벽을 약화시켜 필요한 압력이나 Pass 수를 줄이는 데 활용할 수 있다. |
Commonly used technologies in the lab
대용량 생산에서는 HPH 가 Microfluidizer processor 의 주요 대안이지만, 높은 유량을 확보하는 과정에서 세포 파쇄 방식이 달라져 Scale-up 시 일관성이 저하될 수 있다.
또한 복잡한 밸브의 분해·세척 및 재조립에 전문 지식이 필요해 장비 Downtime 이 증가할 수 있다.
Table 1. Increased yield from a Microfluidizer processor compared to an HPH.
WHY MICROFLUIDIZER TECHNOLOGY?
User-friendly and easy to maintain : Microfluidizer processor 는 사용과 세척이 간편하며, 전문적인 기술 없이도 운용할 수 있고 유지보수가 적다.
High Yield : 효율적인 냉각과 짧은 Residence time 을 통해 단백질 및 효소의 회수율을 높일 수 있다. Microfluidizer processor의 Residence time 은 25?40 ms 로 HPH보다 짧아
열에 의한 변성을 줄이는 데 유리하다.
Table 2. Temperature variation by pass during Microfluidization and HPH
Fast Processing : Microfluidizer processor 는 짧은 시간 내에 세포를 처리할 수 있다. 한 사례에서는 M110EH 에서 15,000 psi, 2 Pass 로 처리한 반면,
Avestin EmulsiFlex-C3 에서는 17,000 psi, 3 Pass 가 필요했다.
Lower Viscosity : Microfluidizer processor 는 1 Pass 후에도 낮은 점도를 나타내며, 추가 Pass 에 따라 점도가 더욱 감소한다.
낮은 점도는 여과 및 정확한 Pipetting 과 같은 후속 공정을 용이하게 한다.
Improved Filtration : Microfluidizer processor 는 세포를 효율적으로 파쇄하면서 상대적으로 큰 세포벽 Fragment 를 생성한다.
생성 입자 크기는 450 nm 로 HPH 의 190 nm 보다 크며, 이러한 큰 Fragment 는 세포 내용물과 쉽게 분리되어 여과 및 원심분리 효율을 높일 수 있다.
Table 3. Yield of Microfluidizer in comparison with Bead Mill and HPH
Microfluidizer processors typically rupture >95% of E.coli cells in 1 pass
Yeast S.Cerevisiae Brewer's/Bakers yeast G10Z 30,000pis. Unlyzed, 1 pass, 5 passes, 10 passes
Tips for using a Microfluidizer processor in cell disruption
| 1. |
Pre-mix 를 과도하게 혼합하지 않는다. Vortex mixing 은 공기를 혼입하여 장비의 흐름을 방해할 수 있으므로 Gentle agitation 으로 세포를 현탁한다. |
| 2. |
Cooling bath 에는 Ice-water 를 사용하고 필요에 따라 보충한다. |
| 3. |
세포 파쇄에는 Z-type interaction chamber (IXC) 를 사용하며, 필요한 경우 APM 을 Upstream 에 배치하여 추가적인 Pre-dispersion 을 수행할 수 있다. |
| 4. |
세포 종류에 맞는 Processing pressure 를 설정한다. E. coli 와 같은 Gram Negative 세포는 상대적으로 쉽게 파쇄되지만, Gram Positive 세포는 두꺼운
Peptidoglycan layer 로 인해 더 높은 Shear force 가 필요하다. |
| 5. |
Over-processing 을 피한다. Pass 수가 증가하면 파쇄율은 높아지지만 과도한 Energy input 과 열 발생으로 단백질 활성이 저하될 수 있으며,
후속 공정 수행에 불리할 수 있다. |
| 6. |
6. 냉동 Pellet 을 사용하는 경우 완전히 해동하고, 세포 농도가 지나치게 높으면 Buffer 를 추가하여 희석한다. Yeast 는 Buffer 에 현탁하기 전에 건조시키지 않는 것이 좋다. |
Conclusion
Microfluidizer® technology 는 세포 파쇄 효율뿐만 아니라 높은 수율, 낮은 점도 및 향상된 분리성을 제공하여 세포 파쇄와 후속 공정에 적합한 기술이다.
또한 세포 종류에 따라 압력과 Pass 수를 최적화함으로써 동물세포부터 효모세포까지 다양한 세포를 효율적으로 파쇄할 수 있다.
cGMP grade M110P Laboratory Microfluidizer Processor
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