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Renee Tobias, Sriram Kumaraswamy, David Apiyo, Sartorius, Fremont, CA


Abstract

바이오치료제 개발과정에서 생체분자의 상호반응을 확인하고 정량화 하는 것은 매우 중요하다. Octet® system 은 형광물질 labelling 을 사용하지 않는 Bio-layer interferometry (BLI) 방법을 사용하는데 이는 binding specificity, affinity, and kinetics 를 매우 신속하고 정밀하게 그리고 실시간으로 확인이 가능하다는 특징이 있다.

protein-protein, protein-drug 과 같은 생체분자사이의 상호반응을 분석하는데 매우효율적인 Octet® system 은 바이오의약품 개발 전체 과정에서 진행되는 수많은 분석 단계에서 모두사용될 수 있는 탁월한 방법이다


Bio-Layer Interferometry (BLI)

BLI 는 light wave 들 사이에 발생하는 interference pattern (간섭 pattern) 을 측정하는 기술이며 Octet® System 은 이 BLI optical analytical technique 을 응용하여 생체분자사이의 interaction을 측정하고 분석하게 된다. BLI 의 개념은 다음과 같다.

biosensor 의 tip 에는 바이오물질이 붙을 수 있는 layer 와 그 안쪽 부분에 reference layer, 두 개의 layer 로 이루어 져 있다. 이 biosensor tip 에 백색광을 조사하면 그 빛은 이 두개의 layer 에서 각각 반사를 하게되고 각 layer 에서 반사된 두 개의 반사광사이에 interference (간섭) 이 발생해 반사광의 진폭이 증폭되거나 감소하게 되고 이 interference 정도를 CCD array detector 가 확인하게 된다.

biosensor 의 tip 을 96-well microplate 의 sample 에 담그게 되면 target 분자들은 layer 의 2-dimensional coated surface 에 binding 하게 되고 점점 더 많은 분자들이 binding 하여 target 분자들의 두께가 두꺼워지면 하나의 layer 를 형성하게 된다.

biosensor tip 에서 두께가 두꺼워지면 biosensor layer 와 reference layer 사이의 거리가 변하게 되어 반사광들사이의 interference pattern 에서 shift 가 일어난다.

즉 반사광의 특이한 pattern 의 shift 는 molecular layer 의 optical thickness 의 변화에 의한 것인데 이는 biosensor 의 표면에 binding 한 분자들의 number 를 의미한다.

이러한 특이적 shift 는 detector 에서 monitoring 되어지고 또한 sensogram 에서 wavelength 의 변화 (nm shift) 로 표시된다.

interference pattern 의 실시간 monitoring 은 molecular interaction 에서의 kinetic data 를 제공하데 됩니다.


Advantages of Label-free Analysis

Octet® system 을 이용한 kinetic characterization 은 분자간 상호작용을 설명하는데 많이 부족했던 ELISA 와 같은 이전의 실험법을 완전히 대체할 수 있게 한다. 복잡한 반응과정에 대한 kinetics, affinity 그리고 activity 를 실시간으로 매우 정밀하게 보여준다. 그리고 분자사이의 상호작용 mechanism 에 대한 상세한 정보도 제공하여 준다.





Figure 2 : A Dip and Read biosensor, illustrating the two optical interfaces at the biosensor tip: the internal reference layer (optical layer) and the surface biocompatible matrix on which ligand molecules are immobilized


Figure 3 : interference pattern of white light reflected from two surfaces. Changes in the number of molecules bound to the biosensor causes a shift in the interference pattern that is measured in real time



Figure 4 : Sensorgram traces from two interactions having similar affinity constants but different binding profiles
Figure 4 의 sensogram 에서 A, B 두 sample 의 affinity constant (KD) 는 비슷하게 보이지만 sample A 의 on-rate and off-rate 는 sample B 에 비해 매우 느린 interaction profile 을 보이고 있다는 것을 알 수 있는데 이러한 데이터는 ELISA 와 같은 기존 분석방법으로는 확인할 수 없는 내용이며 real-time binding assay 인 Octet® System 은 affinity and binding rate data 를 제공하여 interaction 에 대한 완전한 이해를 위한 정보를 제공한다는 것을 알 수 있다.


Binding Kinetics - Basic Principles

Kinetic analysis 는 reversible & non-covalent binding 에서 interaction affinity 와 association and dissociation rate constant 를 측정하는데 사용된다.

상호반응하는 물질 두개중 하나는 Octet® platform 의 Dip and Read biosensor 의 surface 에 immbilization 되고 (ligand) 다른 하나는 sample 용액에 있게된다.

Figure 5 에서 설명되어 있는 것처럼 assay 는 다음과 같은 단계로 이루어진다.

- Baseline : 처음 단계는 assay buffer 를 이용하는 baseline or equilibration step 이다.
- Loading : 그 다음에는 antibody 와 같은 ligand molecule 을 biosensor 의 표면에 immobilization 하게된다.
- Baseline : biosensor 를 buffer solution 에 dipping 하여 ligand 가 완전히 loading 되도록 한다.
- Association : biosensor 를 테스트할 시료가 있는 solution 에 dipping 하여 두 개의 분자간에 binding interaction 이 일어나도록 한다.
- Dissociation : biosensor 를 테스트할 시료가 없는 solution 에 dipping 하여 두개의 분자가 서로 떨어지게 한다.

이러한 과정을 테스트할 시료의 농도가 다른 몇가지 용액에서 (최대 8개) 동시에 시행하여 결과값을 비교 분석한다.


Figure 5 : A typical binding kinetics experiment using Streptavidin Biosensors. A) After an initial baseline step in buffer, biosensors are dipped into solution with biotinylated ligand. In this example, ligand molecule is an antibody. A second baseline step is performed followed by association and dissociation of analyte molecule in solution. B) A raw data sensorgram showing real-time data acquisition for each step of a kinetic assay



 
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