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오늘날 여러가지 유전자치료제가 승인되고 전세계적으로
판매가 이루어지고 있다. 유전자치료제는 유전자 물질을
운반하는 운반체가 필요한데 현재 많이 사용되고 있는
운반체가 viral vector 로서 특히 adenovirus 와
adeno-associated virus (AAVs) 가 유전자치료제
운반체로 널리 사용되고 있다. |
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유전자 물질을 가지고 있는 바이러스의 대량 생산은 주로 동물세포 또는 곤충세포를 이용한다.
AAVs 를 동물세포인 HEK (human embryonic kidney) 세포에 infection 한 후 HEK 를 대량
배양하게 되면 HEK 세포내에는 AAVs 가 대량으로 존재한다. HEK 세포를 분리한 후 세포를
파쇄 (disruption) 시켜 AAVs 만을 순수 분리한다.
전통적인 동물세포 파쇄방법은 세포를 freezing & thawing 시키는 방법인데 이 방법은 작업이
번거롭고 시간이 많이 걸리며 오염의 우려가 있는 등 많은 단점이 있다. 이에 대한 대안으로서
Microfludizer 고압분산장비를 이용한 세포파쇄법이 널리 사용되고 있는데 여기서는 전통적인
freezing & thawing 방법과 Microfluidizer 장비를 이용한 방법의 효율성을 비교하는 테스트를
진행하였으며 그 결과를 소개하고자 한다.
VIRUS RECOVERY TEST
AAV vector 를 HEK293 cells 에서 배양한 다음 TRIS buffer 에서 resuspension 한 다음 cell
lysis 실험에 사용하였다.
freeze-thaw 방법에서는 dryice/isopropanol bath 에서 세포를 얼린 후 다시 37℃ 에서 녹이는
과정을 5 번 진행하였다.
Microfluidizer 방법에서는 H30Z (200㎛) interaction chamber 를 사용하여 4,000psi
(275 bars) 압력으로 suspension 된 세포를 1pass 고압분산 처리하여 세포파쇄를 하였다.
두 실험에서 파쇄된 cell lysate 를 30분간 원심분리 처리하여 cell debris 를 제거하였다.
droplet digital polymerase chain reaction (ddPCR) 방법을 이용하여 AAV 가 얼마나 많이
회수되었는지를 정량하였다.
테스트 결과
Freeze-Thaw 방법의 경우 lysate 에 1,90E+12 vg (vector genome) 이 확인된 반면
Microfluidizer 방법은 lysate 에 2.80E+12 vg 가 확인되었다. 이는 Freeze-Thaw 방법에 비해
Microfluidizer 방법이 약 50% 정도 더 많은 AAVs 를 생산하였다는 것을 의미한다.
또한 Freeze-Thaw 방법은 총 5시간이 소요된 반면 Microfluidizer 방법은 준비과정 등을 포함한
총 작업시간이 1시간이 걸리지 않았다.
이를 통해 우리는 Microfluidizer 방법을 이용한 세포파쇄가 virus recovery 에 매우 효율적이고
그 과정도 매우 편리하다는 것을 확인할 수 있다.
아래 사진은 lysis 하기 전 HEK293 사진과 (좌) Microfluidizer 를 이용하여 cell lysis 한 사진
(우) 이다. 275 bar 압력으로 1 pass 로 세포파쇄 하였을 때 거의 모든 HEK293 세포가
lysis 되었다는 것을 확인할 수 있다.
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