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Introduction
교모세포종(Glioblastoma multiform; GBM) 은 성상 세포 (Astrocytes) 에서 유래한 악성 종양입니다.
GBM의 치료에는 뇌 내 매우 까다로운 위치에 종양이 위치하고, malignant invasion 이 쉽게 일어나고, 종양의 다양성이 크고, 기존 치료법에 대한 저항성이 매우 큰것과 같은 여러 가지 어려움이 있습니다.
이를 극복하기 위한 여러 노력에도 불구하고, in vitro model 로의 전환과 강력한 분석 도구가 부족하여 암세포와 치료제 간의 복잡한 분자적 상호 작용을 이해하는 것에 한계가 있습니다.
기술의 발달로 인해 인간 표현형에 보다 가까운 형태로 primary cell 이나 iPSC 와 같은 세포 모델을 사용할 수 있게 되었습니다.
그로인해, 복잡한 모델에서 관련성 있는 데이터를 정확하게 포착하고 질병 과정에 대한 중요한 이해를 얻기 위해 labeling 없이 하거나 labeling 에 의해 방해 받지 않는 분석 방법의 필요성이 증가하였습니다.
형광 표지를 사용하지 않으면 실험적 관찰이 표지나 표지를 붙이는 과정에 영향을 받지 않을 수 있습니다. 그리고 표지를 붙이는 것이 불가능한 세포(민감하거나 희귀한 세포)를 이용한 실험도 가능해집니다.
Live-cell imaging은 비 교란적(non-perturbing) 방식으로 위상차 이미지를 얻을 수 있게 해줍니다. 이미지 분석에 인공지능(AI)을 도입하면서, 다양한 세포 모델을 정확하게 측정할 수 있게 되어
데이터에 기반한 결정을 내리고 암 생물학을 더 잘 이해할 수 있도록 해주는 강력한 도구가 되었습니다. 이 혁신적인 기술은 신경망 알고리즘을 기반으로 하며, 전통적인 이미지 분석보다
더 복잡하고 이질적인 세포 형태의 정확한 구분을 가능하게 하며, 사용자의 주관적 개입을 최소화 합니다.
이 어플리케이션 노트에서는 통합된 AI 기반 소프트웨어를 사용하여 표지 없이 세포를 구분하고, 개별 세포의 생사 여부를 분류하는 방법에 대해 설명합니다.
또한, 이러한 접근 방식이 임상적으로 중요한 화학요법 치료에 대한 반응으로 신경교세포의 생존에 대한 고속 분석을 어떻게 제공할 수 있는지 예시를 통해 설명하고자 합니다.
Assay Principle
Incucyte® AI Cell-Health 분석 소프트웨어 모듈은 세포의 생존력을 표지 없이 정량화 할 수 있게 해줍니다.
분석 모듈은 Convolutional Neural Networks (CNNs) 을 사용하여 위상차 이미지를 자동으로 분석하고, 개별 세포를 분할한 뒤 살아있는 세포인지 죽은 세포인지 분류하는 작업을 한번에 수행합니다.
이 간소화된 실험 방법 (Figure 1) 을 통해 실험자의 입력을 최소화하며, 편향 없는 결과를 제공하여 서로 다른 실험 간에도 직접적인 비교가 가능합니다.
Figure 1 : Incucyte® AI Cell Health Analysis Workflow
위상차 이미지는 최대 384 well microplate 에서 10배, 20배율로 AI scan 방식으로 얻어집니다. 이미지는 Incucyte® AI Cell Health 분석 소프트웨어 모듈을 통해 분석이 진행되며,
전체 세포 수와 살아있는 세포 및 죽은 세포의 수와 그 비율 등의 지표를 제공합니다. 선택적으로 형광 이미지를 함께 획득한 경우, 전체 세포와 살아있는 세포 또는 죽은 세포의
하위 집단 내의 평균 및 총 통합 형광 강도의 지표도 제공됩니다. 형광 분류는 추가 분석으로 강한 형광 신호 대비 약한 형광 신호 세포의 수 및 비율과 같은 지표를 제공합니다.
전체 세포에 대한 분석뿐만 아니라 살아있는 세포 또는 죽은 세포 하위 집단 내에서의 낮은 형광 강도에 대한 분석도 수행할 수 있습니다.
AI를 이용한 정밀한 세분화를 통해 세포의 밀집도가 높은 조건에서도 정확한 세포 수를 측정하며, 신뢰할 수 있는 세포 증식 데이터를 제공합니다.
표지를 하지 않고 세포가 살아있는지 죽은 것인 것 분류가 가능하여 생리학적으로 의미 있는 비 교란적 환경에서 세포 생존율을 정량화할 수 있습니다.
살아있거나 죽은 세포 하위 집단에서의 선택적 형광 판독과 비 표지 분석을 결합하면 세포 사멸에 대한 추가적인 통찰을 얻을 수 있습니다.
AI-Driven Cell Segmentation
AI Cell Health Segmentation 모델은 각 세포의 경계를 식별하기 위해 사용자의 설명이 들어간 위상차 이미지 데이터를 사용하도록 설계되었습니다.
이로 인해 생성된 Segmentation 결과는 매우 정확하며 다양한 세포 형태에 유연하게 적용될 수 있습니다.
Figure 2 는 다양한 신경교세포 유형에 적용된 AI Segmentation 결과입니다. A172 부착성 교모세포종 세포주, BV2 반부착성 미세아교세포주, rat primary 대뇌성상세포(Incucyte rAstrocytes) 와
Taxol (paclitaxel, 500nM) 에 의해 죽은 T98G 세포의 윤곽을 명확히 인지하고 있는 것을 확인할 수 있다는 것을 보야주고 있습니다.
Figure 2 : Incucyte® AI Cell Health Analysis Accurately Segments a Wide Range of Live and Dead Cell Types With
Diverse Morphologies
AI-Driven Live/Dead Classification
AI Cell Health 분석은 형광 시약 없이도 살아있는 세포와 죽은 세포를 구분하여 식별할 수 있습니다. AI 기반 분류의 유효성을 검증하기 위해, 다양한 세포 유형에 Incucyte® Cytotox Dye 를
함께 처리하여 실험을 진행했습니다. 이 dye는 죽은 세포 내부로 들어가 형광을 발현합니다. 이 어플리케이션 노트에서는 신경교세포를 대상한 실험의 결과를 담고 있습니다(Figure 3).
Figure 3 : Incucyte® AI Cell Health Analysis Produces Cytotoxicity Data Comparable to Standard Fluorescence Methods
T98G, A172, BV2 세포에 세포 사멸을 유도하는 다양한 농도의 화합물을 처리하고, 동시에 Incucyte® Cytotox Green Dye 를 사용하였습니다.
세포 사멸 정량 분석은 Incucyte® AI Cell Health Live/Dead 분류 (label-free) 와 Cytotox 양성 세포의 형광 분류 방식을 모두 사용하여 수행하였습니다.
위상차 이미지와 형광 이미지를 혼합하여 시각화한 결과는 세포 유형별로 살아있는 세포와 죽은 세포를 보여주며 (Figure 3A), 처리한 화합물의 농도 및 시간에 따라 죽은 세포 비율을 나타낸 그래프는
형광 분석과 AI 기반 분석 모두 유사한 결과를 얻을 수 있었습니다 (Figure 3B).
또한, T98G 및 A172 (72시간 처리), BV2 (24시간 처리) 에 대한 농도 반응 곡선 (Figure 3C) 은 두 분석 방식 모두 유사한 결과를 나타냅니다.
이 결과는 여러 신경교세포에서 다양한 작용 기전을 가진 화합물들에 의해 유도된 세포 사멸을 AI를 기반으로 하는 비 표지 Incucyte® 분석이 정확하게 식별할 수 있음을 보여주었습니다.
Chemotherapeutic Response of Glioblastoma Cells in Microplate Throughput
교모세포종(GBM)의 유전적 이질성 (Genetic Heterogeneity) 은 잘 알려져 있으며, 이는 발병 또는 재발에 대해 효과적인 화학요법이 부족한 주요 원인 중 하나입니다.
세포 성장과 생존을 조절하는 Akt-PI3K 세포 내 신호 경로는 종양 억제 인자인 PTEN (Phosphatase and Tensin Homolog) 에 의해 음성 조절 됩니다.
PTEN 기능의 상실은 통제 되지 않은 세포 증식과 종양 내 약물 저항성과 관련이 있으며, 전체 GBM 환자의 최대 80% 에서 결실되거나 돌연변이 된 PTEN 유전자가 발견됩니다.
종양 저항성과 관련된 유전적 변이 및 기전에 대한 정보는 보다 정밀하고 새로운 치료 전략을 개발하는 데 있어 중요한 기초 자료가 됩니다.
약물 감수성을 평가하기 위해 서로 다른 PTEN 발현 상태를 가진 세 교모세포종 세포주를 대상으로 작용 기전이 다양한 항암제에 대한 반응을 비교했습니다.
96 well plate에서 A172(PTEN Negative), T98G(PTEN Expressing), U870MG(PTEN Deficient)세포에 대해 13종의 항암제를 고농도 및 저농도로 처리하였습니다) (Figure 4).
시간 경과에 따라 죽은 세포의 비율을 나타내는 microplate view (Figure 4A) 와 72시간에서의 히트맵 (Figure 4B) 을 통해 세포주 간 감수성 차이를 나타내는 약물을 식별할 수 있었습니다.
위상차 이미지 (Figure 4C) 는 분석된 세포 사멸 수준을 시각적으로 확인하는데 사용되었습니다.
대부분의 약물에서 U87-MG 세포는 A172, T98G 세포에 비해 낮은 세포 사멸 비율을 보였습니다. 이는 U87-MG 세포의 약물 감수성이 감소되어있음을 의미합니다.
Figure 4 : Label-Free Screening of Glioblastoma Responses to Chemotherapeutic Compounds in Microplate Format
세포 사멸에서 뚜렷한 차이를 보였던 4종의 항암제에 대해 추가로 실험을 진행하였습니다.
교모세포종 세포주를 96 well plate에 배양한 후 3회 연속 희석한 cisplatin, Taxol(paclitaxel), vinblastine, doxorubicin 을 처리 후 3일 동안 관찰 하였습니다 (Figure 5).
각 약물의 농도-반응 곡선(Figure 5A)는 72시간 시점에서 나타나며, EC50 (반응의 절반을 유도하는 농도) 과 최대 세포 사멸 비율 (Figure 5B) 을 함께 관찰하였습니다.
이 데이터를 통해 작용 기전이 다른 약물과 세포주 사이에서 약물 독성 효과 차이를 확인할 수 있었습니다.
특히, U87-MG 세포는 T98G, A172 세포에 비해 모든 약물에 대해 낮은 감수성을 보였습니다.
고형암 치료에 널리 사용되는 항암제인 Taxol 은 A172 와 T98G 세포에서 73.8%, 76.6% 의 세포 사멸 효과가 나타났고, 두 항암제 모두 EC50 값은 0.003 μM 으로 나타났습니다.
반면, U87-MG 세포에서는 최대 세포 사멸이 27.1%, EC50 은 0.014 μM 로 더 높은 값이 측정 되었습니다.
이러한 결과는 PTEN 상태가 이들 약물의 효과를 조절하는 복합적인 신호 조절 경로 중 하나의 요인일 수 있음을 시사합니다.
이번 연구는 비 표지 분석 방식이 고 처리량 (high-throughput) 조건에서도 신뢰성 있게 사용될 수 있으며, 약물 저항성에 영향을 미치는 유전적 요인들을 비편향적 방식으로
깊이 있게 탐구할 수 있는 잠재력을 보여주었습니다.
Figure 5 : Profiling Cell Death Responses to Concentration Ranges of Chemotherapeutic Compounds in Glioblastoma Cell Lines.
Label-Free Analysis Enables Examination of Compound Mechanisms of Action in Primary Astrocytes
전통적으로 신경종양학 분야는 신경모세포종이나 교모세포종과 같은 종양 세포주를 이용해 연구를 하였습니다.
종양 세포주를 이용한 연구는 유용하지만, 실제 뇌종양에서 나타나는 복잡성과 이질성을 완전히 재현하지 못한다는 단점이 있습니다.
이러한 한계로 인해, 최근에는 iPSC (유도 만능 줄기 세포) 나 primary cell 처럼 더 민감하고 희귀한 세포를 이용한 연구가 증가하고 있습니다.
보다 더 실제 질병에 가까운 세포 모델을 활용한 약물 개발을 지원하고 그 속도를 높이기 위해서는, 생리적으로 간섭을 최소화하는 in vitro 분석법과 정밀한 데이터 분석 기법의 지속적인 개발이 필수적입니다.
Figure 6 : Label-Free Analysis of Compound Mechanisms of Action.
AI 를 이용한 비 표지 분석의 유용성을 입증하기 위해 primary astrocytes 에서 약물 작용 기전을 살펴보았습니다.
쥐의 대뇌 피질 성상 세포에 대해 okadaic acid (이중 단백질 인산화 효소 억제제) 와 Monastrol (kinesin-5 의 소분자 억제제) 을 여러 농도로 처리하고
Incucyte Live-Cell Analysis System 을 사용하여 3일간 관찰하였습니다 (Figure 6).
처리 72간 후 이미지에서 AI 기반 생존/사멸 세포를 분류한 결과, okadaic acid (300 nM) 는 세포 사멸을 유도했고, Monastrol (600 μM) 은 세포 독성이 관찰되진 않았지만
vehicle 처리군과 비교했을 때 세포의 형태학적 변화를 유도한 것으로 관찰 되었습니다 (Figure 6A).
세포 사멸 정량 결과, okadaic acid는 농도 의존적 세포 독성 효과를 보였고 (Figure 6B), Monastrol 은 세포 사멸이 유도되지는 않았으나 농도가 증가함에 따라 세포 증식이 감소하는
all-or-nothing 방식의 세포 정지 효과 (cytostatic effect) 를 보였습니다(Figure 6C).
이는 알려진 작용 기전과 일치하여 AI 를 이용한 비 표지 분석법이 생리학적으로 세포에 영향을 주지 않고 화합물 효과를 평가하는데 적합함을 의미합니다.
Combined Live-Cell Analysis and Flow Cytometry Approach Yields Additional Insights into Cell Death
중추신경계에서 미세아교세포 (microglia) 는 감염이나 손상에 반응하는 식세포 (phagocyte) 로서의 역할을 주로 수행합니다.
병리학적 조건에서는 교종 (glioma) 에 연관된 미세아교세포가 종양 미세환경에서 중요한 역할을 하며, 종양 유전자 신호에 반응하여 케모카인 (chemokine) 과 사이토카인 (cytokine) 을 분비함으로써
종양의 진행을 촉진하는 것으로 알려져 있습니다. 현재 연구는 이러한 생물학적 역할과 상호작용에 대한 이해를 확장하는 데 초점을 맞추고 있으며, 미세아교세포를 표적으로 하는 치료법은
기존 치료법을 보완할 수 있는 가능성이 있는 치료법입니다.
Live-Cell Analysis 와 Advanced Flow Cytometry 을 결합한 분석법을 통해 미세아교세포 세포주에서 세포 사멸을 조사 하였습니다.
Incucyte® AI Cell Health Analysis 소프트웨어 모듈은 비 표지 방식으로 세포 사멸을 실시간으로 모니터링할 수 있고 분석 과정에서 세포를 고갈시키지 않기 때문에 실험 종료 시점을 유연하게 설정할 수 있다.
자세한 세포 사멸 기전 분석을 위한 추가 실험도 가능하게 한다. iQue® Human 4-Plex Apoptosis Kit 은 flow cytometry 기반의 다중 파라미터 분석법으로 well 당 네 가지 세포 사멸 지표 - caspase 3/7 활성,
annexin V 결합, 세포 생존율, 미토콘드리아 막 전위 (MMP) - 를 정량화할 수 있습니다 (Figure 7).
BV2 세포에 대해 DNA 손상을 유발하고 세포 사멸 경로를 활성화하는 것으로 알려진 3가지 항암제 (camptothecin [CMP], cisplatin [CIS], carboplatin [CAR]) 를 처리하였습니다.
이미지 촬영은 2시간 간격으로 수행되었으며, Incucyte® Live-Cell Analysis System 을 통해 세포 사멸을 모니터링하였고, 약물 처리 24시간 후 세포를 수집하여 iQue® Apoptosis Kit 의
no-wash 프로토콜에 따라 염색하였습니다.
Sample은 iQue® Adcanced Flow Cytometry 플랫폼을 통해 측정하였고, Forecyt® 소프트웨어를 이용하여 분석하였습니다. Figure 7 의 데이터는 각 세포 사멸 지표에 대한 게이팅 전략을 보여주고 있다 (Figure 7A).
Forecyt® 히트맵은 camptothecin 과 cisplatin 처리에 따라 caspase 양성 세포 비율이 농도 의존적으로 증가하는 것을 확인할 수 있었고, carboplatin 에 대해서는 부분적인 증가가 관찰되었습니다 (Figure 7B).
네 가지 세포 사멸 지표 모두 유사한 반응이 나타났습니다.
Figure 7: Combined Approach to Quantify Cell Death in Microglia Using Live-Cell Analysis and Flow Cytometry.
항암제 효능에 대한 Incucyte® 의 비 표지 분석 결과와 iQue® 의 caspase 양성 결과를 비교한 농도 반응 곡선은 유사한 결과를 보여주었습니다 (Figure 7C).
예를 들어, camptothecin 의 경우 EC50 값이 각각 0.35 μM 과 0.34 μM 으로 관찰되었습니다. 이러한 접근법은 각 세포 사멸 경로를 더욱 정밀하게 조사하는 데에도 활용될 수 있으며,
caspase 의존적 또는 독립적 메커니즘을 평가하는 데도 응용 가능하다는 것을 보여줍니다.
Summary & Conclusion
교종 (glioblastoma) 과 같은 종양세포가 세포 독성 항암 화합물에 반응하는 과정은 복잡하고 역동적이며, 신경종양학(neuro-oncology) 연구에서 반드시 이해해야 할 핵심 주제입니다.
Incucyte® AI Cell Health Analysis 소프트웨어 모듈은 사전 학습된 신경망을 활용하여 개별 세포를 정밀하게 분할 (segmentation) 하고, 이를 생존 세포 또는 사멸 세포로 분류할 수 있습니다.
이 어플리케이션 노트에서 제시된 데이터를 통해 이 기술이 glial cell 유형에서의 세포 독성 평가에 있어 강력하고 신뢰할 수 있는 접근법임을 보여주며, 치료 후보 물질의 스크리닝에도 적합하다는 것을 입증하였습니다.
비 표지 (label-free) 분석은 세포에 스트레스를 유발하지 않는 비침습적 방식으로 세포 독성을 정량화할 수 있게 해주며, 이는 특히 민감한 세포 유형을 사용할 때 매우 유용합니다.
또한, 이 분석 방식은 동일 sample 에서 세포 사멸 기전에 대한 후속 연구를 위한 flow cytometry 와 같은 분석을 이어서 수행할 수 있도록 해줍니다.
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