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Real-time Live-Cell Analysis of 3D Organoid growth in Matrigel® domes |
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Introduction
Organoid 기술의 발전은 인간 질환의 중개 연구, 질병 모델링, 재생 의학, 그리고 예측적 정밀 치료에 새로운 지평을 열고 있습니다.
Organoid는 다양한 줄기세포 (SCs)를 이용해 3차원 ECM (Extracellular Matrix) 에서 in vivo 환경과 유사하게 구조적, 유전적 다양성을 갖도록 만든 1차 미세 조직 (Primary Macro Tissues) 입니다.
또한 Organoid 는 self-organizing과 self-renewing 이 가능하다는 장점이 있어, 기존의 monolayer culture 방식보다 다양한 응용 가능성과 잠재력을 가지고 있습니다.
Organoid 를 기초 연구, 질병 모델링, 약물 스크리닝 등에 효과적으로 활용하기 위해서는 구체적이고 신뢰성 있는 in vitro 배양 및 분석 방법이 필수적입니다.
현재 Organoid 가 시간에 따라 형성되고 성장하는 과정을 객관적으로 모니터링하는 방법이 제한적이어서, 배양에 따른 특성 파악과 최적화가 충분히 이루어지지 않고 있습니다.
Incucyte® Live-Cell Analysis System 과 Incucyte® Organoid Analysis Software Module 은 organoid 배양 과정의 표준화, 특성화 및 최적화를 위한 효과적인 해결책을 제공합니다.
Incucyte® Live-Cell Analysis System 은 명시야 현미경을 통해 Matrigel dome 안에서 배양 중인 Organoid 의 실시간 동역학적 이미징을 수행하며, Organoid 의 크기, 개수, 형태학적 지표를
시간에 따라 자동으로 수집합니다. 이를 통해 분화 및 세포 성숙 특성에 대한 분석이 가능합니다.
Monitoring and quantifying organoid growth in Matrigel® domes.
Mouse Intestinal, Pancreatic, Hepatic Organoid 는 Matrigel dome 내부에 넣어 24 well plate 에서 배양하였고, 6시간마다 이미지를 얻었고, Organoid 의 성장, 분화 및 세포 성숙은 시간에 따른
Organoid 의 크기 변화를 추적한 결과를 토대로 Incucyte Organoid Software Analysis Module 을 사용해 분석하였습니다.
Figure 2. Acquisition and quantification of organoid growth in Matrigel® domes.
Mouse intestinal (1:3 split, 50% Matrigel), pancreatic (1:5 split, 100% Matrigel®) and hepatic organoids (1:40 split, 100% Matrigel®) were
embedded in Matrigel® domes in 24-well plates and imaged every 6 h in an Incucyte. Brightfield (BF) images of the entire Matrigel® dome (top)
show organoid maturation 6 days post seeding. Note accurate segmentation (yellow outline mask) and distinct phenotypes of mature
organoids (bottom). Time-course plots showing the individual well total BF area (μm2) over time (h) demonstrate cell type specific organoid
growth. All images captured at 4X magnification. Each data point represents mean ± SEM, n = 4 wells.
Incucyte 를 통해 Matrigel dome 안에서 배양중인 Organoid 를 단일 초점의 2차원 이미지로 시각화할 수 있었고, 확대한 명시야 현미경 이미지와 시간에 따른 세포의 형태학적 특징과
성장 양상을 확인할 수 있었습니다 (Fig 2).
성숙한 hepatic 및 pancreatic Organoid 는 빠르게 크기가 커지는 것을 관찰할 수 있었고, 장 Organoid 는 크기는 상대적으로 작지만 기관 특유의 표현형이
나타나는 것을 확인할 수 있었습니다.
Optimization and characterization of organoid cultures using real-time kinetic measurements.
Measuring proliferation to optimize growth conditions and seeding densities
Organoid seeding density를 최적화하기 위해, mouse hepatic Organoid를 Matrigel domes에 1:10에서 1:40까지 다양한 비율로 seeding 하였습니다.
명시야 현미경 이미지와 Organoid의 면적을 정량화 한 결과, Organoid의 성장 속도와 크기는 seeding 한 세포의 수에 비례하는 것을 확인할 수 있었습니다 (Fig 3).
Figure 3. Determine optimal conditions for maximal organoid expansion.
Mouse hepatic organoids were embedded in Matrigel® domes (100%) in 48-well plates at multiple seeding densities. BF Images (5 d post seeding)
and time-courses of individual well area and count demonstrate density-dependent organoid growth. Data were collected over 168 h at 6 h intervals.
All images captured at 4X magnification. Each data point represents mean ± SEM, n=14 wells.
Measuring morphological features to define optimal organoid maturation phase
Organoid passaging 을 최적화 하기 위해, Mouse hepatic Organoid 를 Martrigel domes 에서 8일간 배양하며 Incucyte로 관찰하였습니다.
Seeding 2일 후 대부분의 Organoid 는 직경이 100 μm 미만이었고, lumen 이 뚜렷이 형성된 것을 명시야 현미경 이미지를 통해 관찰할 수 있었습니다.
또한, seeding 후 24시간 이내에 Organoid 가 형성되고, 시간이 지날수록 편심률 (eccentricity) 이 감소하는 것을 관찰할 수 있었습니다.
Seeding 후 4일~5일이 지난 시점에서 Organoid 는 최대 크기에 도달했고, 둥근 형태를 형성한 것을 확인할 수 있었다.
6일이 지난 뒤 Organoid가 붕괴하며 점차 어두워지는 것을 관찰할 수 있었다.
이를 통해 Organoid 계대 배양의 최적 시점은 4일~5일 사이라는 것을 알 수 있었습니다 (Fig 4).
Figure 4. Define cell-type specific passage frequency using integrated morphology metrics.
Hepatic organoids were embedded in 100% Matrigel® domes (1:10 split) in 24-well plates. Tracking changes in organoid eccentricity (object roundness) and
darkness (object brightness) enabled rapid assessment of optimal culture passage periods. Images (day 6) and time-course data demonstrate that organoids
that reached maximal size collapsed (increased eccentricity) and darkened (increased darkness). Data were collected over 192 h at 6 h intervals.
All images captured at 4x magnification. Each data point represents mean ± SEM, n=6 wells.
Tracking organoid differentiation and growth efficiency through passages
Passage 에 따른 intestinal Organoid 의 성장 효율을 평가하였습니다.
Seeding 된 세포의 수가 같다면, intestinal Organoid 는 passage 에 관계 없이 유사한 개수, 면접, 편심률, 암흑도 (darkness) 가 측정 되는 것을 알 수 있었습니다 (Fig 5).
또한, intestinal Organoid 특유의 표현형 역시 passage 에 관계 없이 관찰 되었습니다.
Figure 5. Assess growth and differentiation efficiency of organoids across multiple passages.
Intestinal organoids were embedded in 50% Matrigel® domes (1:3 split, 24-well plate) over multiple passages and evaluated for growth and differentiation consistency over time.
BF images (7 days post seeding) and corresponding plots show comparable morphology and growth across passages.
Data were collected over 192 h at 6 h intervals. All images captured at 4X magnification.
Each datapoint represents mean ± SEM, n=6 wells.
Conclusions
이번 Application Note 에서는 Incucyte® Live-Cell Analysis System 과 Incucyte® Organoid Analysis Software Module 을 통해 Organoid 형성과 성장을 동역학적으로 평가하였습니다.
이를 통해 다음을 입증할 수 있었습니다.
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24 well, 48 well plate 모두에서 Matrigel domes 에 배양한 Organoid 를 분석할 수 있는 능력. |
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Real-time, label-free 로 배양 조건과 방법을 최적화하는 방법. |
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형태학적 매개변수를 기반으로 Organoid 의 Passaging 또는 extension 의 최적 시점을 결정. |
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장기간 계대 배양을 이어온 Organoid 의 상태를 평가하는데 활용될 수 있음. |
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