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Introduction
세포의 생물학적 과정인 프로그램 된 세포 사멸은 정상적인 조직 유지 및 발달에 필요한 과정입니다.
그러나, 잘못된 세포 사멸 신호 전달 과정은 신경 퇴행, 자가 면역 질환과 암을 포함한 수 많은 질병에 연관되어 있습니다.
세포 사멸은 세포막 표면의 pro-apoptosis 수용체를 활성화 시키는 외부 요인에 의해 시작 되거나 DNA 손상, 저산소증, 성장 인자의 부재, 세포 주기의 결함
그리고 미토콘드리아에서 cytochrome C의 방출을 유도하는 여러 유형의 세포 스트레스와 같은 자극에 의해 시작됩니다.
대부분의 세포 사멸은 caspases(cysteinyl aspartate proteinases) 로 분류되는 단백질들의 활성화로 시작됩니다.
Caspase-3 또는 capase-7 로부터 시작된 세포 사멸은 비가역적으로 돌이킬 수 없는 결과를 낳기에 이 두 단백질은 세포 사멸의 가장 강력한 지표로 사용됩니다.
또한, 세포막 외부로 노출된 phosphatidylserine(PS) 도 세포 사멸의 고전적 지표로 사용되고 있습니다.
PS 는 식세포에게 세포 사멸중인 세포라고 인식하는데 사용되는 단백질로 정상 세포에서 세포막 안쪽을 향하고 있으나 세포 사멸이 시작 된 세포의 PS는 세포막 외부 표면으로 노출됩니다.
Caspase-3/7 의 활성화나 세포막 외부의 노출된 PS 를 측정하도록 고안된 분석법으로 Flow-cytometric(유세포 분석법) 이나 enzyme 을 이용한 분석법
그리고 plater-reader를 이용한 분석법이 고안되었습니다. 대다수의 Caspase-3/7 분석법은 enzyme이 인식할 수 있는 DEVD(Asp-Glu-Val-Asp) peptide motif 에 결합하는 방식을 사용하고 있습니다.
Caspase-3/7의 motif에 luciferase, colormetric 혹은 fluorometric reagent 와 같은 시약을 사용하여 활성화 된 caspase-3/7 을 확인할 수 있습니다.
또다른 대표적인 분석법인 Annexin V 는 PS 에 대해 높은 친화성과 특이성을 가진 재조합 단백질로, 세포사멸을 확인하는데 사용할 수 있습니다.
Fluoroprobe 와 결합된 Annexin V 를 사용하는 세포 사멸 분석법은 세포막 외부 표면으로 노출된 PS를 검출하기에 최적화 되어 있습니다.
Annexin V 를 이용한 세포 사멸의 분석에는 일반적으로 유세포 분석법으로 측정합니다.
기존의 세포 사멸 분석법의 가장 큰 단점은 사용자가 정의한 시험 종료 시점(end point) 에서 측정을 한다는 것입니다.
또한, 세포를 측정 가능한 형태로 sampling을 하는 과정의 wash 혹은 cell lifting 과정이 필요한데, 이 과정에서 세포 사멸 과정에 있는 세포의 손실과 PS 비대칭성 손실로 이어질 수가 있습니다.
그리고 시간이 지남에 따라 배경 신호가 증가하기 때문에 장기적인 측정에 적합하지 않습니다. 생세포 이미징 분석 방법이 개발되었지만,
세포 사멸을 유연하고 정확하게 평가하기 위한 최적화된 기술과 시약이 부족하기에 세포 사멸에 대한 장기 측정이 불가합니다.
이 Application Note 에서는 wash 없이 사용하는 reagent 와 세포 사멸의 정량화를 위한 최적화된 통합 이미지 기반 분석 도구를 포함하는 Incucyte® Apoptosis Assays 의 가치를 설명하고자 합니다.
Assay Principle
Incucyte® Apoptosis Assays 는 Incucyte® 를 활용하는 분석법입니다. Incucyte® Live-Cell Analysis System 과 함께 Caspase-3/7 또는 Annexin V dye 를 사용하면 세포 사멸을 실시간으로 자동 측정할 수 있습니다.
Incucyte® Caspase-3/7 dye 는 DEVD peptide로 구성된 비활성, 비형광 기질로 세포막을 자유롭게 통과하여 세포 안으로 들어간 뒤, 활성화된 caspase-3/7 에 의해 절단되어
녹색, 빨간색 또는 주황색(for metabolism) 으로 형광 표지 된 dye 가 DNA에 결합합니다. 세포 사멸이 시작된 세포는 형광으로 표지 된 핵이 드러나 관찰할 수 있게 됩니다(Figure 1A).
A. Overview of Incucyte® Caspase-3/7Dye
B. Overview of Incucyte® Annexin V Dye
Figure 1 : Schematics Demonstrating Principles of Incucyte® Apoptosis Assays
Incucyte® Annexin V dye 는 매우 밝고 광안정성이 높은 cyanine fluorescent dye 를 표지로 사용합니다.
세포 사멸이 시작되어 세포막 외부로 노출된 PS 와 결합하면 녹색, 빨간색, 주황색 또는 근적외선(NIR) 신호를 방출합니다(Figure 1B).
통합 분석 소프트웨어는 세포로부터 나온 형광 신호를 정량화 하고 배경 신호는 최소화 합니다.
세포사멸 신호는 (cell shrinkage, membrane blebbing, nuclear condensation, DNA fragmentation) Incucyte® 의 고화질 위상차 영상과 결합되어 세포 사멸에 대한
추가적인 생물학적 통찰력과 형태학적 검증을 제공합니다.
Materials and Method
Incucyte® Apoptosis Assay 는 96/384-well plate 에서 간단한 mix-and-read protocol 을 사용하여 수행할 수 있습니다 (Figure 2).
이 분석법은 adherent cell 혹은 non-adherent cell 를 포함하여 모든 세포에 사용할 수 있고, 비침습적이기에 유연하게 적용하여 세포에 대한 효과를 실시간으로 정량화할 수 있습니다.
또한, Incucyte® Nuclight dye, Incucyte® Cytotox dye 와 Incucyte® Confluence Assay 를 함께 이용하여 세포 증식이나 세포 독성, 세포 사멸에 대한 다양한 결과를 얻을 수 있습니다.
Figure 2 : Quick Guide of Incucyte® Apoptosis Assay Protocol for Adherent Cells
Validation Data
Quantification of Apoptosis
Incucyte® Live-Cell Analysis System 을 이용하여 세포 사멸과 함께 실시간으로 약물 처리에 대한 반응으로 유도되는 caspase-3/7 의 활성 또는 PS 노출을 시각화 하고 정량화할 수 있습니다.
HT-1080 fibrosarcoma cell 을 Incucyte® Annexin V Red dye 와 항암제인 Cisplatin (CIS; 12.5 μM) 을 함께 처리하였습니다 (Figure 3).
이후 위상차 및 혼합 형광 이미지를 통해 세포 사멸의 형태학적 특징을 관찰하고 Annexin V 와의 결합을 평가하였습니다.
이미지 기반 분석 도구는 전체 실험 시간 동안 형광 (파란색) 으로 표지 된 세포들을 자동으로 분할하여 세포사멸을 정량화할 수 있습니다.
CIS 처리로 인해 HT-1080 세포의 세포 사멸이 유도되었다는 것을 확인하였고, Incucyte® Annexin V Red dye 가 세포막 외부로 노출된 PS에 결합하여 형광이 증가된 것도 확인할 수 있었습니다.
또한, 획득한 이미지를 통해 세포사멸 판독 결과 세포 사멸과 관련된 형태학적 변화의 상관관계를 파악할 수 있었습니다.
Figure 3 : Visualization and Quantification of HT-1080 Fibrosarcoma Cells in Response to the Anti-Cancer Drug
Cisplatin (CIS) in Real-Time.
Pharmacological, Kinetic Analysis of Apoptosis
Incucyte® Apoptosis Assay 는 화합물 처리에 대한 세포사멸 반응을 대량으로 관찰할 수 있게 해줍니다. 약물 독성 검사를 위해 A549 cancer cell 에서 약리학적 연구를 수행하였습니다.
세포는 Incucyte® Annexin V NIR dye 가 있는 상태에서 4가지 다른 화합물의 2배 연속 희석 된 희석액으로 처리되었고 형광 표지는 통합 소프트웨어를 사용하여 자동으로 분석되었습니다 (Figure 4A).
화합물이 처리된 모든 plate 에서 형광 표지의 증가가 관찰 되었고, 화합물 마다 세포에 대해 다른 반응을 유도한다는 것이 관찰되었습니다.
Camptothecin (CMP), Cisplatin (CIS) 그리고 Staurosporine (SSP) 은 농도 의존적인 효과가 관찰되었지만, Nocodazole 에서는 모든 농도에서 낮은 수준의 세포 사멸이 관찰되었습니다.
이어서 일반적으로 세포사멸을 유도하는 화합물로 사용되는 DNA 합성 억제제인 CMP 에 대한 세포 사멸 반응을 관찰하였습니다 (Figure 4B).
72시간 동안의 데이터를 농도-반응 곡선으로 변환하면 A549 세포에 대해 농도 의존적 효과를 확인할 수 있습니다.
대조 조건에서는 형광 표지의 증가가 관찰되지 않았습니다.
위상차 및 혼합 형광 이미지는 세포 사멸과 관련한 형태학적 변화를 보여주고 다양한 약물의 질적 비교를 가능하게 해줍니다(Figure 4C).
이 결과는 약물로 유도된 세포 사멸의 관찰 결과를 시각화 및 정량화를 함에 있어 Incucyte® Apoptosis Assay 의 유용성을 보여주며, live-cell 분석이 대량의 약리학적 연구에 적합하다는 것을 보여줍니다.
Figure 4 : Pharmacological Analysis of Apoptosis in a High-throughput Manner
Multiplexed Measurements of Proliferation and Apoptosis
Live-Cell Analysis System 을 이용한 세포 사멸과 세포 증식의 다중 측정을 위해 Incucyte® Apoptosis Assay 와 핵에 표지를 하는 Incucyte® Nuclight Reagents 를 함께 사용할 수 있습니다.
해당 분석법을 보여주기 위해 Incucyte® Nuclight NIR 로 표지한 HT-1080 fibrosarcoma cell 에 Caspase-3/7 dye 와 CMP 를 3배 연속 희석하여 처리하였습니다 (Figure 5).
CMP 처리 후 NIR 핵 형광 (pseudo-colored blue) 이 감소하고 녹색 형광이 염색된 DNA가 증가하는 것을 위상 및 혼합 형광 이미지로 확인할 수 있었습니다.
이를 통해 caspase-3/7 이 활성화 되었음을 알 수 있었습니다.
통합 소프트웨어를 사용하여 형광을 자동으로 추적하고 세포 사멸 (green) 과 세포 증식 (NIR) 을 정량화 하였습니다.
HT-1080 세포에 대한 CMP의 세포 사멸 및 항증식 효과가 농도 의존적으로 나타난다는 것을 정량화 분석을 통해 확인할 수 있었습니다.
이 데이터를 통해 2색(two-color) 분석법이 약물 처리를 통해 유도되는 세포 사멸 및 항증식 효과를 분석하는데 다매개변수적(multiparametric) 접근 방식을 제공할 수 있다는 것을 보여주며,
drug discovery 단계에서 새로운 화합물의 효과를 조사함에 있어 잠재력이 있는 분석법이라는 것을 보여줍니다.
Figure 5 : Investigation of Compound Effects Using Multiplexed Measurements of Apoptosis and Proliferation
Assessment of Cell Health in Subpopulations of Cells
Incucyte® Cell-by-Cell Analysis Software Module을 사용하면 위상 이미지에서 개별 세포를 분할하고 분할된 경계 내에서 형광과 관련된 세포 별 지표를 추출할 수 있습니다.
통합 소프트웨어 분석을 통해 형광 특성을 기준으로 세포 집단을 분류할 수 있습니다. 이를 다중 분석과 함께 사용하면 하위 집단의 세포의 건강 상태를 빠르게 정량화할 수 있습니다.
해당 분석법을 보여주기 위해 Incucyte® Nuclight Red (nuclear viability marker) 를 안정적으로 발현하는 HT-1080 fibrosarcoma cell 에 Comptothecin(CMP; cytotoxic)
혹은 Cyclohexamide(CHX; Cytostatic) 과 Incucyte® Caspase-3/7 Green dye 를 함께 처리하였습니다 (Figure 6).
2시간마다 10배 확대 이미지로 촬영하고 세포 하위 집합을 Cell-by-Cell Analysis 를 사용하여 빨간색과 녹색의 형광 강도에 따라 분류하였습니다.
각 화합물의 대표적인 위상 및 형광 이미지와 분류 플롯은 세포가 1)빨간색, 2)빨간색과 녹색, 3)녹색으로 분류되는 방식을 표시합니다.
이러한 하위 집단의 시간적 추적은 CMP 가 생존 가능한 세포의 손실을 나타내는 1)빨간색 집단의 감소, 2)조기 세포 사멸을 나타내는 빨간색과 초록색 집단의 증가,
3)24시간 이상 이후 늦은 세포 사멸을 나타내는 초록색 집단의 증가를 유도하였음을 보여주었습니다.
초기 세포 사멸 집단 (빨간색과 녹색) 의 시간 경과는 HT-1080 세포에서 CMP 에 대한 농도 의존적 세포 사멸 반응을 보이며, 이는 세포 독성 작용 기전과 일치합니다.
반면, CHX 처리에서는 테스트 된 농도에서 세포 사멸을 유도하지 않았지만 시간이 지남에 따라 일정한 적색 집단(생존 가능) 을 유지 하였으며, 이는 세포 독성 작용 기전과 일치합니다.
전반적으로, 데이터는 Incucyte® 세포 별 분석을 다중 분석과 함께 사용하면 약물이 세포의 생존에 영향을 주는 치료 효과에 대한 역동적인 통찰력을 얻을 수 있으며
특정 세포 유행에 대한 치료적 작용 매커니즘을 식별하는데 적용할 수 있음을 보여주었습니다.
Figure 6 : Investigation of Cell Health of Subpopulations of Cells Following Different Compound Treatments
Summary and Outlook
세포 사멸은 여러 병리와 관련된 복잡하고 역동적인 과정이며, 다양한 치료 영역에서 이 매커니즘에 대한 더 깊은 이해를 필요로 하고 있습니다.
Incucyte® Caspase-3/7 과 Annexin V dye 를 Incucyte® Live-Cell Analysis System 을 사용한 실시간 이미지 분석과 결합하면 실시간으로 변화하는 세포의 반응에 대해 정량적인 결과를 얻을 수 있습니다.
Incucyte® Apoptosis Assay 는 생리학적으로 관련된 조건에서 caspase-3/7 의 활동 또는 세포막 밖으로의 PS 노출을 통해 세포 사멸 신호 전달의 완전한 역학적 판독을 제공합니다.
세포 사멸 신호 전달 경로의 역학 및 타이밍에 대한 통찰력을 제공하는 것 외에도 최적의 분석 종료점을 결정할 필요성을 없애줍니다.
이는 세포 유형과 화합물 처리 조건에 따라 상당히 달라질 수 있습니다. 이 접근 방식은 획득한 이미지를 사용하여 데이터를 검증하고 세포 사멸과 관련된 형태학적 변화를 평가할 수도 있습니다.
나아가 세포 증식 측정과 함께 다중화 된 세포 사멸 판독을 통해 더 많은 통찰력을 얻을 수 있으며, Incucyte® Cell-by-Cell 분석과 함께 사용하면 개별 세포 하위 집단의 세포의 생존을 추적할 수 있다는
추가 이점이 있습니다. 이러한 분석은 다양한 실험 설정(Table 1) 에 적합한 새롭고 유연한 방법을 제공하여 약물 발견과 기본 세포 생물학 연구 모두에 대한 세포 사멸 경로 분석을 가능하게 합니다.
Table 1. Incucyte Dyes for Live-Cell Imaging and Analysis of Cell Health
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