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Introduction
세포가 Cytotoxicity 자극에 노출되면 대사 활동이나 성장이 저해될 수 있으며, 궁극적으로는 Necrosis 나 Apoptosis 와 같은 세포 사멸에 이르게 됩니다.
또한, Cytotoxic 화합물은 종종 기전에 상관없이 세포막의 손상을 유발하며, 세포막이 회복될 수 없을 정도로 손상을 입게 되면 결국 사멸됩니다.
Apoptosis 동안에는 Pseudopodia 의 수축, Pyknosis, Karyorrhexis, 그리고 궁극적으로는 세포막의 무결성 상실과 같은 Morphology 변화가 일어납니다.
Necrosis 를 특징짓는 Morphology 변화는 세포질 부종과 초기 세포막 파열이 포함됩니다.
Cytotoxicity 를 측정하는 분석법은 특정 조직에 대한 독성을 예측하거나 항암 치료제를 찾고 분류하는 데 사용됩니다.
의료기기의 생체 적합성 역시 Cytotoxicity 분석을 통해 이루어지며, Incucyte® Cytotoxicity 의 세포 기반 Cytotoxicity 테스트로 평가할 수 있습니다.
일반적으로 사용되는 Cytotoxicity 분석법은 여러가지 요소를 동시에 평가합니다. 세포막이 파열된 후 방출되는 Lactate dehydrogenase (LDH) 효소와
Glutathione (GSH), Reactive oxygen species (ROS) 의 생성, Cell proliferation, 그리고 미토콘드리아 막 전위의 파괴와 같은 다양한 최종 대사 활동 측정이 포함되며,
세포막 파괴 여부를 평가하기 위해 Propidium iodide 나 형광 현미경, 유세포 분석을 위한 기타 염색제가 사용됩니다.
이러한 분석법의 중요한 요소로는 화합물의 농도와, 화합물이 효과를 나타내는 데 걸리는 시간이 있습니다.
Multiplex 분석법은 여러 가지 Cytotoxicity 지표를 동시에 측정할 수 있지만, 일반적으로 한 시점에서만 평가가 이루어지기 때문에 시간에 따라
생물학적 활동이 어떻게 변화하는지 평가하지는 못합니다. 세포막의 손상 여부를 동적으로 측정하기 위해 실시간으로 세포를 분석할 수 있는 방법이 개발되었지만,
정확한 평가를 위해서는 최적화된 기술과 시약이 필요합니다.
본 노트에서는 세척 없이 사용 가능한 Mix-and-read 시약과 통합된 이미지 기반 분석 도구를 활용한 Incucyte® Cytotoxicity 분석법의 유용성을 설명합니다.
Assay Principle
Incucyte® Cytotoxicity 분석법은 Incucyte® Cytotox 염료와 Incucyte® Live-Cell 분석 시스템을 사용합니다.
세포막 무결성에 기반하여 약물 또는 환경적 요인으로 인한 세포 사멸을 실시간으로 측정할 수 있습니다.
Incucyte® Cytotox 염료는 매우 민감하며, 세포에 첨가해도 세포 성장이나 형태에 거의 영향을 미치지 않습니다.
그러나 세포의 세포막에 손상이 생겨 Incucyte® Cytotox 염료가 세포 내부로 침투할 수 있게 되면, 염료가 DNA에 결합하면서 형광이 100배에서 1,000배 증가합니다 (Figure 1).
시간이 지남에 따라 형광으로 표지된 녹색, 빨간색 또는 근적외선 (NIR) 핵이 나타남으로써 사멸하는 세포를 식별하고 정량화할 수 있습니다.
Incucyte® 통합 분석 소프트웨어를 통해 형광 물체는 자동으로 정량화되며, 배경 형광은 최소화됩니다.
또한 Incucyte® HD 위상차 이미지 및 동영상을 통해 세포의 Morphology 변화 (예: 세포 골격 구조 상실, 운동성 감소)를 바탕으로 세포 사멸을 확인할 수 있습니다
[Figure 1] Live-Cell Incucyte® Cytotoxicity 분석 원리
세포막을 통과하지 못하는 DNA 염색약인 Incucyte® Cytotox 는 세포가 Cytotoxic 물질에 의해 세포막이 손상되었을 때만 세포 핵을 염색합니다.
Necrosis 의 특징으로는 세포질의 팽창과 세포막 손상이 포함됩니다. 생존 세포는 Incucyte® Cytotox 염료에 의해 염색되지 않으며, Incucyte® Cytotox 염료가 있는 상태에서도
성장에 영향을 받지 않습니다.
Materials and Methods
Incucyte® Cytotoxicity 분석법은 간단한 Mix-and-read 프로토콜을 사용하여 효율적으로 수행할 수 있습니다 (Figure 2).
이 분석법은 매우 유연하여 부착성 세포 또는 비부착성 세포 등 원하는 세포를 사용해 비침습적으로 분석할 수 있으며, 처리 효과를 실시간으로 정량화할 수 있습니다.
또한 Incucyte® Cytotox 염료는 핵 염색을 위한 Incucyte® Nuclight 시약 및 Incucyte® Annexin V 염료 또는 Incucyte® Caspase-3/7 염료와 결합할 수 있어
세포 증식과 사멸을 동시에 측정할 수 있습니다
[Figure 2] 부착, 비부착 세포에 대한 Incucyte® Cytotoxicity Assay 프로토콜 모식도
프로토콜은 Incucyte® Cytotox 염료와 Incucyte® Live-Cell 분석 시스템을 사용하여 이미지 기반 형광 측정을 통해 Cytotoxicity 를 측정합니다.
Validation Data
Quantification of Cytotoxicity
Incucyte® Live-Cell Analysis System과 Incucyte® Cytotox 염료를 함께 사용하여 Cytotoxicity 를 시각화하고 정량화할 수 있습니다. Figure 3은 비부착성 림프모구성
백혈병 세포주인 Jurkat 이 항암제 Camptothecin (CMP) 에 반응하는 Cytotoxicity 반응을 실시간으로 정량화하는 것을 보여줍니다.
Jurkat 세포에는 Incucyte® Cytotox NIR 염료와 함께 CMP 3 μM 가 처리되었으며, 24시간 동안 Cytotox NIR 염료가 핵산에 결합하는 양이 증가하는 것이 관찰되었습니다.
또한 이미지를 통해 Cytotoxicity 와 관련된 Morphology 변화가 세포막 손상으로 인한 것이며, 이는 Jurkat 세포의 사멸에서 나타나는 전형적인 Halo 효과로 확인되었습니다
[Figure 3] 암제 Camptothecin 처리된 비부착성 Jurkat 세포 사멸을 Incucyte® Live-Cell 분석 시스템을 사용하여 실시간 시각화 및 정량화하는 모습
Jurkat 세포 (20,000 Cells/well)는 Incucyte® Cytotox NIR 염료와 함께 3 μM CMP로 처리되었습니다.
실험 기간 동안 20 배율, 2 시간 간격으로 이미지를 촬영하였습니다.
Incucyte® Cytotox NIR 염료의 핵산 결합 증가를 NIR 물체 수로 측정할 수 있으며, 세포 사멸과 관련된 Morphology 변화와 연관될 수 있습니다
이 방법은 Cytotoxicity 를 효율적이며 정량적으로 연구하는 데 유용하게 사용될 수 있습니다.
이를 입증하기 위해 Incucyte® Cytotoxicity Assay 를 사용하여 HT-1080 섬유육종 세포를 사용하여 네 가지 다른 화합물의 Cytotoxicity 를 조사했습니다.
세포는 Incucyte® Cytotox Green 염료와 함께 0.78부터 50 μM 까지 다양한 농도의 화합물을 처리하고 통합 소프트웨어를 사용해 형광값을 분석하였습니다 (Figure 4).
각 Well 의 동적 형광 변화를 72시간 동안 측정한 결과 (Figure 4A), Camptothecin (CMP) 은 테스트한 모든 농도에서 강한 Cytotoxicity 효과를 보였습니다.
그에 반해 Cisplatin (CIS), Staurosporine (SSP) 및 Nocodazole (NOC) 은 농도 의존적으로 Cytotoxicity 효과를 나타내었습니다.
이러한 데이터는 Incucyte® Cytotoxicity Assay가 Cytotoxicity 의 시각화 및 정량에 유용하며, 실시간 세포 분석이 약리 연구에 매우 효율적이라는 것을 보여줍니다
[Figure 4] High-Throughput Cytotoxicity 자동 분석
HT-1080 섬유육종 세포 (2,000 Cells/well)에 Incucyte® Cytotox Green 염료와 4가지의 서로 다른 화합물을 처리했습니다.
(A) Incucyte® Cytotoxicity 분석은 96/384-Well Plate 의 모든 Well 을 자동으로 이미지화하고 분석하여 시간에 따른 Cytotoxicity 값을 제공합니다.
(B) 시간 경과에 따른 변화와 48시간 시점에서의 농도-반응 곡선은 Cisplatin (CIS; 50 - 0.78 μM) 이 HT-1080 세포에 미치는 효과가 농도 의존적임을 보여줍니다
Profiling of Single Compounds Across Multiple Cancer Cell Types
Camptothecin (CMP) 은 DNA 효소인 Topoisomerase I (TOPO I) 을 억제하여 세포 사멸을 유도하는 화합물로 Cytotoxicity 연구에 널리 사용되는 화합물입니다.
약리학적 연구에서 세 가지 다른 암세포주, A549, SKOV3, MDA-MB-231 를 대상으로 CMP 를 처리한 후 Incucyte® Cytotoxicity Assay 의 Cytotoxicity 평가 능력을 확인하였습니다 (Figure 5A).
시간에 따른 Cytotoxicity 정량 결과 A549 세포에서 가장 강한 Cytotoxicity 반응이 나타났으며, SKOV3와 MDA-MB-231은 각각 낮은 수준의 형광이 관찰되었습니다 (Figure 5B).
또한, 72시간 후의 농도에 따른 반응 곡선과 그것을 통해 유도된 EC50 값을 통해 Cytotoxicity 를 직접 비교할 수 있었습니다 (Figure 5C).
본 실험 결과는 CMP 의 Cytotoxicity 효과가 암세포주 마다 다르다는 것으로 보여주며, Incucyte® Cytotoxicity Assay 가 강력한 실시간 세포 분석법을 제공 할 수 있음을 보여줍니다.
[Figure 5] 다양한 암 세포주에서의 치료 효과 분석
Incucyte® Cytotox Green 염료와 함께 Camptothecin (CMP) 을 10?0.16 μM의 다양한 농도로 처리하였습니다.
(A) 위상 및 형광 이미지는 CMP (1.25 μM) 처리된 세포와 Vehicle로 처리된 세포의 72시간 후의 Cytotox 형광 및 Morphology 변화를 보여줍니다.
(B) 각 세포주 별 시간 경과에 따른 CMP의 Cytotoxicity 반응을 Green Object Count 로 측정한 결과입니다.
(C) 농도-반응 곡선 (72시간)으로 변환된 데이터는 세포주 간의 약리학적 비교를 가능하게 합니다
Multiplexed Measurements of Proliferation and Cytotoxicity
Incucyte® Cytotox 염료는 Incucyte® Nuclight Reagents 와 결합하여 핵을 표지할 수 있습니다. 이를 통해 Incucyte® Live-Cell Analysis System을 사용하여 Cytotoxicity 와 Cell Proliferation 을 동시에 측정할 수 있습니다. 여기에서는 Incucyte® Nuclight Red HT-1080 섬유육종 세포에 단계적으로 희석한 CMP와 Incucyte® Cytotox Green 염료를 처리하였습니다 (Figure 6). Time-lapse 이미지는 CMP 처리 후 붉은색 핵 형광이 감소하는 것과 동시에 Incucyte® Cytotox Green 염료의 핵산 결합이 증가하는 것을 보여줍니다. Incucyte® 통합 분석 소프트웨어를 사용하여 녹색 형광 신호를 통해 세포 사멸을 정량하고, 붉은색 형광을 모니터링하여 세포 증식을 추적했습니다. 정량 결과 CMP는 농도 의존적으로 Cell Proliferation 을 억제하고 Cytotoxicity 를 증가시켰습니다
이러한 데이터는 다중 매개 변수를 통한 분석이 신약 개발에 유용하다는 것을 보여줍니다.
[Figure 6] 화합물 효과 평가를 위한 다중 세포독성 측정 및 생세포 계수
Incucyte® Nuclight Red Lentivirus 로 미리 표지된 HT-1080 섬유육종 세포 (5,000 Cells/well)에 Camptothecin (CMP; 33.3?0.001 μM)을 처리한 후 Incucyte® Cytotox Green Dye 의
존재 하에 살아있는 세포와 사멸한 세포를 시간 경과에 따라 검출했습니다.
Subpopulation Analysis of Cytotoxic and Cytostatic Treatment Effects
Incucyte® Cell-by-Cell Analysis Software Module은 위상차 이미지에서 개별 세포를 분할하고, 분할된 경계 내에서 형광과 관련된 지표를 세포별로 추출할 수 있습니다.
통합 분석 소프트웨어를 사용하여, 세포 집단은 형광 특성을 기준으로 분류할 수 있습니다.
여기에서는 두 가지 다른 기전을 가진 화합물들이 전체 세포 집단에 미치는 영향을 관찰하였습니다.
Proliferation 을 통한 세포 수의 증가는 Label-free, Cytotoxicity 는 Cytotox Dye fluorescence classification 을 사용하였습니다 (Figure 7).
실험을 위해 두 가지 약물 (Camptothecin (CMP), Cycloheximide (CHX)) 이 사용되었습니다. DNA 합성을 저해하는 CMP 는 세포 사멸을 유도하는 Cytotoxic 화합물로 예측되며,
단백질 합성을 저해하는 CHX 는 세포의 생존에는 영향을 미치지 않고 증식을 억제할 것으로 예상되었습니다.
이 두 약물 (10?0.004 μM) 을 Incucyte® Cytotox Green 염료와 함께 HT-1080 섬유육종 세포에 처리하였습니다.
세포의 하위 집단은 Cell-by-Cell Analysis Software를 사용하여 녹색 형광을 기준으로 분류하였으며,
각 약물의 위상 이미지와 혼합 형광 이미지는 세포가 어떻게 생존 또는 사멸 상태 (녹색) 로 분류되는지 보여줍니다.
세포수 계산 (Label-free) 및 Cytotoxicity 지수의 계산 (전체 세포 중 사멸한 세포의 비율) 은 Incucyte® 소프트웨어에서 수행되었으며,
두 약물이 Proliferation 과 Cytotoxicity 에 미치는 효과가 차등적임을 보여줍니다.
CMP는 농도 의존적으로 HT-1080 세포 사멸을 유도하여 Cytotoxic 메커니즘이 있음을 보여주고 있습니다.
반면, CHX 는 통계적으로 유의한 Cytotoxicity 가 관찰되지 않았으며, 대신 농도 의존적으로 세포 증식을 억제하고 있음을 보여줍니다.
결론적으로 이 접근법은 약물 유도 치료 효과와 작용 기전에 대한 통찰력을 제공할 수 있음을 보여줍니다.
[Figure 7] Live-Cell Label free 세포 및 Cytotox 판독을 통한 세포 아형 집단에서의 약물 메커니즘 조사
HT-1080 섬유육종 세포 (5,000 Cells/well)는 Camptothecin (CMP; Cytotoxicity) 또는 Cycloheximide (CHX; Cytostatic) 로 처리되었으며,
Incucyte® Cytotox Green Dye 와 함께 사용되었습니다. 위상 및 형광 이미지를 통해 세포 별로 24시간 후 생존 / 사멸 여부를 감지할 수 있습니다.
Summary and Outlook
세포 사멸은 동적 과정이며, Cytotoxicity 를 모니터링하는 것은 종양학과 같은 많은 치료 분야에서 중요합니다.
Incucyte® Live-Cell 분석 시스템과 Incucyte® Cytotox 염료를 사용하여 Cytotoxicity 를 실시간 동적 분석한 결과, 세포 사멸의 특징인 세포 투과성을 정량적으로 분석할 수 있음을 확인하였으며,
생리학적인 조건에서 Morphology 변화를 모니터링하면서 동시에 정량화할 수 있습니다.
Incucyte® Cytotox 염료와 Incucyte® Nuclight 시약 또는 세포주를 결합하여 Proliferation 과 Cytotoxicity 를 다중 분석할 수도 있으며,
Incucyte® Cell-by-Cell 분석 소프트웨어를 통해 개별 세포를 형광 기반으로 분류하여 Cytotoxicity 지수 또는 Apoptosis 지수와 같은 추가 매개변수를 계산하여
세포 집단에 대한 약물의 작용 기전을 평가할 수도 있습니다.
Incucyte® Cytotoxicity Assay 는 약리학적 연구에 적합한 강력하고 유연한 도구이며, 시간에 따른 세포 사멸 패턴에 대한 더 깊은 통찰력을 제공합니다.
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