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Overview
Incucyte® Live-Cell Analysis System 은 세포 배양기 안에서 자동으로 세포의 이미지를 촬영하고 그 이미지를 분석하는 기기입니다.
이 장치에서 multi-well 의 세포들은 동적분석에 사용되므로 매우 오랜 기간 배양되어야 합니다.
그러므로 이 세포들은 실험기간동안 충분한 영양을 공급하여 매우 건강한 상태를 유지하여야 하고 재현성 있는 세포 이미지 촬영이 가능하도록 최선의 컨디션을 유지하여야 합니다.
오랜 기간 세포의 변화를 계속적으로 관찰할 때 고려하여야 하는 요소들은 전통적인 end-point/single time-point 분석에서는 필요하지 않으나
Incucyte® Live-Cell Analysis System 을 이용하여 장기간에 걸친 세포의 변화에 대한 최고의 분석 결과를 구하기 위해서는 이런 모든 요소들을 최적화 하는 것이 매우 중요합니다.
Best Practices - Cell Seeding
Cell Density :
대부분의 세포 분석실험에서 세포 밀도는 분석 결과에 매우 큰 영향을 미치는 중요한 요소입니다.
세포가 100% 융합에 가까워지면, cell contact inhibition 이 일어나 세포의 성장 속도를 늦추고 세포 건강에 영향을 미칠 수 있습니다.
일반적으로 adherent cell 배양에는 1,000-5,000 cells, suspension cells 배양에는 5,000-30,000 cells 의 낮은 cell density 를 유지하는 것이 좋습니다.
그러나 Incucyte® Scratch Wound Migration and Invasion Assays 와 같은 일부 실험은 Cell Density 에 의해 크게 영향을 받는데 이 경우 100% 에 가까운
Cell Density 가 필요합니다
그러므로 세포 분석 실험에서는 그 실험에 적합한 Cell Density 를 유지하여야만
고품질 이미지를 촬영, 처리, 분석하고 최종적으로 재현성이 탁월한 실험 결과를 얻을 수가 있습니다.
Cell Settling :
세포가 well 내부에서 고르지 못하게 분포하고 있거나 또는 well 간 다르게 분포하고 있다면 live-cell assay 에서 구한 데이터의 신뢰성에 큰 영향을 미치게 됩니다.
특히 plate 의 외부에 위치한 well 의 경우 세포가 well 가장자리 또는 정중앙에 집중되는 현상이 가끔 발생하는 데 이런 경우 데이터 신뢰성 때문에 해당 well 을 사용하지 않게 됩니다.
well 내부에서의 세포 분포는 세포 배양액이 가열되면서 발생하는 배양액의 흐름 (convection currents) 에 의해 발생됩니다.
이 순간 유체 흐름에 세포가 부유해 있으면 이러한 흐름에 의해 세포가 이동할 가능성이 높아집니다.
이러한 영향을 최소화 하기 위해서는 Cell Seeding 실온에서 최소 20분 동안 (chemotaxis 와 같은 실험에서 suspension cell 의 경우 45-60분) 평평한 표면에서
세포가 가라앉도록 하는 것이 매우 중요합니다.
이 시간동안 세포는 well 의 바닥으로 가라앉아 culture plastic 또는 surface coating 과 상호 작용하여 세포의 이동을 억제하여 세포를 균일하게 분포하게 됩니다.
Surface Coating :
Well 의 Surface Coating 은 배양 세포의 성장과 건강에 미치는 영향이 크고 특히 세포를 장기간 배양하면서 분석실험을 하는 경우에는 그 중요성이 더욱 증가됩니다.
Cell Proliferation 관련 연구와 같은 일부 Functional Assay 실험에서는 Non-Adherent (Suspension) Cell Line 을 Poly-L-Ornithine (PLO) 과 같은 코팅물질을 사용하여
용기 표면에 부착시켜야 합니다. 그러나 Adherent Cell Line 의 경우에는 일반적으로 코팅이 필요하지 않습니다.
Neuronal Assays, Stem Cell Assay 그리고 Chemotaxis 같은 더 복잡한 Functional Assay 실험에서는 Adherent Cell Line 과 Non-adherent Cell Line 모두
Surface Coating 물질이 필요할 수 있습니다.
Surface Coating 물질은 poly-D-lysine, poly-L-ornithine, laminin, fibronectin 또는 gelatin 등이 있습니다.
Sartorius 의 Assay Protocols 에는 2D 및 3D Application 별 Surface Coating Pptimization 에 대한 자세한 설명이 나와 있습니다.
Best Practices - Well Volume Plate Type
Well 안 액체의 적당한 용량은 Cell Health 유지외에도 세포 촬영시 이미지 변형을 방지하는데에도 매우 중요한 역할을 합니다.
Well 의 액체 부피가 너무 적으면 촬영된 이미지 화질에 문제가 생기게 됩니다.
그러므로 대부분 실험에서는 정해진 용량도 조금 더 많은 용량의 세포 배양액을 넣어주는 것이 좋습니다.
Incucyte® Live-Cell Analysis System 은 application 또는 software module 에 따라 수백 가지 이상의 세포배양용 well 용기를 지원할 수 있습니다.
Plate Type
■ 96-well plates :
일반적으로 well 당 50-200 μl 용량의 media 를 권장하는 데 이 용량범위에서 적은 용량은 24시간 정도의 Short-Term Assays 에 많이 사용되고
큰 용량의 경우 배양 시간이 긴 경우 또는 세포 배양액을 갈아 주면서 배양하는 경우에 적합합니다.
표준적인 well 안의 배양액의 용량은 100 μl 입니다.
■ Flat vs. Round Bottom :
well 당 40-80 μl 의 배양액을 권장하는 데 이 용량범위에서 하한선과 같이 적은 용량은 24시간 정도의 Short-Term Assays 에 많이 사용되고 상한선은 장기 실험( 48시간 이상 ) 또는
세포 배양액을 갈아 주면서 배양하는 경우에 적합합니다. Sartorius 가 권하는 표준 배양액의 용량은 60 μl 입니다.
■ 384-well plates :
Round Bottom type 의 well 이 Flat Bottom type 의 well 보다 더 많은 양의 배양액을 담을 수 있으며 Incucyte® Single Spheroid Assays 에서는 주로 Round Bottom type 을 많이 사용합니다.
오랜 기간 세포 배양을 진행하는 경우에는 약간 더 많은 양의 배양액을 넣어 주는 것이 이후의 Partial Media Exchange 에 도움이 됩니다.
Assay Set Up
■ Assay Type :
배양기간이 짧은 실험에서는 well 당 적은 volume 으로 진행하는 것이 유리한 면도 있겠지만 well 당 volume 이 너무 적으면 촬영 이미지 상태가 안좋을 경우도 발생한다.
Spheroid 와 Chemotaxis 와 같은 Assay 에서는 최적의 분석 방법을 위해 프로토콜에 권장 용량이 명시되어 있습니다.
일반적으로 40-50 μl 미만의 배양액은 사용하지 않는 것이 좋습니다.
■ Assay Duration :
실험자는 Cell Health 를 유지하기 위해 적절한 실험 기간을 생각하여야 합니다.
분석 기간이 길거나 도중에 배지 교환을 하여야 하는 경우에는 일반적인 실험때 보다는 좀 더 많은 배지를 넣어 주어야 합니다.
■ Scan Frequency :
세포의 이미지 촬영을 너무 자주하게 되면 Incucyte® 시스템의 메커니즘으로 인해 더 많은 열이 발생하고 배지의 증발이 빠르게 진행될 수 있습니다.
그러므로 세포 이미지 촬영을 자주 하여야 할 경우에는 well 에 배지를 더 많이 넣어주는 것이 좋습니다.
Best Practices - Assay Media
Media Formulation :
일정 기간 세포를 배양한 후 그 세포로 부터 어떤 특정 현상을 분석하는 전통적인 연구방식에서는 연구자들이 자신이 선호하는 세포주와 특정 배지를 사용하여
기능적 분석을 최적화하는 경우가 많습니다. 일부 연구자들은 이러한 경험을 살려 Live-Cell Imaging 에서도 관찰하고자 하는 세포배양을 자기가 선호하는 배지에서
진행하고자 하는 경우가 가끔 있습니다.
예를들어 Green Channel 을 이용하여 세포를 촬영할 때 배지에 있는 Riboflavin 이 배경 형광을 강하게 발생시키기도 합니다.
이를 방지하기 위해 Riboflavin 함량이 높은 배지 대신 Riboflavin 함량이 낮은 배지를 사용하는 것이 더 적합할 수 있습니다.
또한 조성이 다른 배지에서 세포를 배양할 경우 그 세포주의 특성이 변하기도 하는데 이렇게 되면 오랜 기간 세포를 배양하게 되면 아주 치명적인 결과가 나오기도 합니다.
예를 들어 특성이 다른 배지에서 세포를 배양하면 세포의 증식과 이동 방식이 달라질 수도 있습니다.
이런 이유로 해서 특히 Chemotaxis 와 같은 실험에서는 최적의 세포주 성능을 위해 배지의 조성을 최적화 하는 것이 중요합니다.
배지를 준비할 경우에는 배지에 넣어주는 FCS 와 성분들은 0.22 μm filter (such as the Sartorius Minisart®) 로 filtering 해 줄 것을 권장합니다.
Media Exchanges :
세포배양시에는 일반적으로 2-3일 마다 배지를 교환하게 되는데
이러한 관행은 특히 72시간 이상 세포배양을 진행하는 Longterm Kinetic Assay 과 같은 실험에서는 세포에 필수 영양소를 공급하기 위해 매우 중요한 작업입니다.
그러나 Toxicity assays 와 Phagocytosis Bioparticle Assay 와 같은 실험에서는 이러한 배지 교환을 해서는 안됩니다.
또한 세포의 membrane 에 문제가 생기기 시작하는 Assay 인 경우에도 media change 를 해서는 안됩니다.
그리고 Suspension Cell 의 경우에는 이 세포들이 어떤 표면에 부착되어 있더라도 media exchange 하게 되면 다른 분석 결과가 나올 가능성이 있습니다.
그러므로 실험자는 자기가 사용하는 Assay 의 특성과 기간을 제대로 할고 media exchange 가 필요한 지 아닌지 잘 결정하여야 합니다.
신경세포와 같은 민감한 세포의 경우, 샘플을 보존하기 위해 배지를 한번에 전체 교환하는 것보다는 배지의 약 반 정도만 교환할 것을 추천합니다.
Best Practices - Objects Within Light Path
Incucyte® Live-Cell Analysis System 은 투과된 빛을 이용한 이미징 시스템이기 때문에 만약 빛 경로 내에 어떤 물체가 있으면 이로 인해 쵤영된 이미지에 왜곡 현상이 나타날 수 있습니다.
그러므로 이러한 이미지 왜곡현상을 방지하기 위한 몇가지 권장 사항이 있습니다.
■ Bubbles :
Bubble 은 imaging system 의 light path 에 간섭 현상을 일으켜 Incucyte® 의 데이터분석에 악영향을 미치는 high contrast (고대비) 물질입니다.
Incucyte® 에서 사용하기 위한 용기를 준비할 때는 기포 형성을 최대한 억제하기 위해 Reverse Pipetting 사용을 권장합니다.
기포가 여전히 존재하는 경우 내부 빨대를 제거한 lab wash bottle 에 70% 에탄올을 조금 넣고 well 위로 vapor 를 불어 bubble 을 제거할 수 있습니다.'
에탄올은 멸균되어 있으므로 샘플을 오염시키지 않으며, 기포의 표면 장력을 낮추는 데 도움이 됩니다
■ Condensation :
세포 배양에 사용되는 vessel 을 culture hood 에서 습하고 따뜻한 incubator 안으로 이동 시키면 vessel plastic 표면에 응결이 생기게 됩니다.
이 결과 생기는 물방울이 vessel 을 통과하는 빛의 투과에 영향을 미치게 됩니다.
이 현상을 방지하기 위해서는 이미지 촬영을 시작하기 20분전에 vessel 을 따뜻하게 만들어 물방울이 증발할 수 있도록 해주는 것을 권장합니다.
20분간 기다리기가 힘들 경우에는 sample vessel 을 준비하는 동안 그 이후에 사용할 추가 vessel 을 미리 따뜻하게 하고
그런 다음 뚜껑을 교체하여 따뜻한 뚜껑을 Incucyte® 분석에 사용하면 즉시 이미징을 시작할 수 있습니다.
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