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Kerri Wolf-Dennen, Nancy Gordon, and Eugenie S. Kleinerman
Department of Pediatrics, The University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX, USA |
Introduction
골육종 (osteosarcoma) 은 뼈에서 발생하는 악성 종양입니다. 이 종양은 (1) 종양 촉진 (tumor-promoting), (2) 면역억제성 M2 대식세포 (immunosuppressive M2 macrophages),
(3) M1 항종양성 대식세포 (M1 antitumorogenic macrophages) 와 밀접한 관련이 있습니다. 이러한 여러가지 세포 내부에 존재하는 엑소좀 (Exosomes) 은
세포에서 분비되는 세포외 소포체 (extracellular vesicles) 로써 세포내 통신 (intracellular communication) 역할을 하며, 대식세포 표현형 (macrophage phenotype) 및
활성화 (macrophage activation) 에 영향을 미치며 암세포에 의해 세포 밖으로 방출됩니다.
본 논문에서는 골육종에서의 면역억제성 M2 대식세포 (immunosuppressive M2 macrophages) 와 골육종 세포주 (cell ine) 의 엑소좀이 서로 미치는 영향에 대하여 연구하였습니다.
Results
| 1. |
골육종 세포 엑소좀 (osteosarcoma cell exosomes) 은 비전이성 세포와 전이성 세포에서 추출했습니다.
비전이성 세포는 K7 세포, Dunn 세포이며 전이성 세포는 K7M3 세포, DLM8 세포입니다. 추출 후 Cell Tracker CM-DiI 적색 형광으로 라벨링 하였고,
이를 밤새 배양한 쥐의 폐포 대식세포 (Alveolar macrophages) 에 24시간 동안 처리했습니다.
그 결과 대식세포 (Alveolar macrophages) 가 골육종 세포 엑소좀을 섭취하는 것을 확인했습니다.
그림 (a) 는 IncuCyte Live-Cell System 로 측정한 결과이며 그림 (b) 는 형광현미경입니다.
형광현미경과 마찬가지로 IncuCyte 로 측정한 결과도 선명하며 cell 의 대식 작용을 명확하게 확인할 수 있습니다. |
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Fig. 2. : Alveolar macrophages can uptake osteosarcoma cell exosomes. Osteosarcoma cell exosomes were extracted from non-metastatic K7 and
Dunn cells and from metastatic K7M3 and DLM8 cells via ultracentrifugation and then labeled with Cell Tracker CM-DiI red fluorescent dye.
Alveolar macrophages were cultured overnight and then treated with labeled osteosarcoma cell exosomes for 24 h.
Both fluorescent and bright field images were collected using the (a) IncuCyte Live-Cell System at 20× and the (b) Nikon Eclipse Ti de-convolution inverted bright field
and fluorescent microscope at 60× under oil immersion. Osteosarcoma cell exosomes are shown in red and DAPI in blue. Bright field images are also included,
as well as the merged images from all three channels. |
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| 2. |
비전이성 골육종 세포의 엑소좀과 다르게 전이성 세포의 엑소솜 (Metastatic osteosarcoma cell exosomes) 은 폐포 대식세포의 식균 작용 (alveolar macrophage phagocytosis) 과
대식 세포의 종양 세포 제거 (macrophage-mediated tumor cell killing) 현상을 억제합니다.
(a) 폐포 대식세포 (MHS 세포)에 골육종 세포 (비전이성 세포: K7 및 Dunn, 전이성 세포: K7M3 및 DLM8)의 엑소좀을 처리하여 24시간 동안 배양했습니다.
IncuCyte pHrodo 표지 시약으로 골육종 세포를 표지했으며 IncuCyte S3 Live-Cell Analysis 시스템으로 촬영한 이미지를 IncuCyte 소프트웨어로 분석하여
식세포 활동 (Phagocytic activity) 을 측정했습니다. 비전이성 세포보다 비전이성 세포인 K7M3 및 DLM8에 대해 20시간에서 상당한 억제(p < .05)가 관찰되었습니다.
(b) IncuCyte 로 Effercytosis 를 관찰했습니다. Effercytosis는 dying apoptotic cells 를 제거하는 과정입니다. 이를 위해 항암제 gemcitabine 을 24시간 동안 처리한 골육종 세포를
pHrodo 표지 시약으로 표지한 다음 MHS 세포 배양액에 첨가했습니다. 전이성 세포인 K7M3 및 DLM8 에 대하여 각각 12시간 및 30시간에서 상당한 억제 현상이 (p < .05) 나타났습니다.
반대로 비전이성 세포인 K7 의 경우 24시간에 상당한 향상 현상이 (p < .05)이 나타났습니다.
(c) IncuCyte 로 macrophage-mediated cytotoxicity 대한 엑소좀의 효과를 평가했습니다. 골육종 세포를 밤새 배양한 다음 IncuCyte Caspase 3/7 green apoptosis reagent 으로 표지했습니다.
MHS 세포를 4개의 골육종 세포주에서 배출된 엑소좀과 함께 밤새 배양한 다음 표지된 골육종 세포에 첨가했습니다. PBS로 처리된 MHS 세포가 대조군입니다.
그 결과 전이성 세포 K7M3 및 DLM8에 대해 24시간에 상당한 억제(p < .05)가 나타났습니다. 반대로 비전이성 세포 Dunn의 경우 24시간에 상당한 개선(p < .05) 을 확인할 수 있습니다.
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| 3. |
이번에는 쥐의 대식세포가 아닌 인간의 대식세포를 대상으로 실험했습니다. 이전과 마찬가지로 전이성 골육종 세포의 엑소좀은 대식세포의 phagocytosis 을 감소시키고,
macrophage-mediated tumor cell killing 을 억제함을 알 수 있었습니다.
(a) Human monocytes (THP1 cells) 를 밤새 PMA(150ng/mL)로 배양 후 IncuCyte pHrodo labeling reagent 으로 라벨링된 골육종 세포 (비전이성 세포: SAOS2, 전이성 세포: LM7) 를
추가했습니다. IncuCyte S3 Live-Cell Analysis 시스템과 IncuCyte 소프트웨어로 분석한 데이터를 사용하여 식세포 활동 (Phagocytic activity) 을 측정했습니다.
LM7 세포의 엑소좀은 20시간에서 Phagocytic activity 에 있어 상당한 억제(p < .05)를 유도했습니다.
(b) 골육종 세포를 밤새 배양한 다음 IncuCyte Caspase 3/7 green apoptosis reagent 으로 표지했습니다.
THP1 세포를 두 골육종 세포주의 엑소좀에 노출시킨 후 골육종 세포주를 추가했습니다.
IncuCyte S3 Live-Cell Analysis 시스템을 사용하여 세포 독성 (Cytotoxicity) 을 측정하고 데이터를 IncuCyte 소프트웨어로 분석했습니다.
전이성 세포 LM7 의 엑소좀과 함께 배양한 THP1 세포는 세포독성 활성 (cytotoxic activity) 의 현저한 억제(p < .05)가 관찰되었습니다.
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| 4. |
전이성 세포 K7M3 및 DLM8 의 엑소좀은 transforming growth factor beta 2 (TGFB2) 를 유도하며 이는 대식세포의 기능을 억제합니다. 쥐의 대식세포(MHS 세포) 를
배양한 다음 골육종 세포 (비전이성 세포: K7 및 Dunn, 전이성 세포: K7M3 및 DLM8)의 엑소좀과 함께 48시간 동안 배양했습니다.
(a) 배양 배지에서 interleukins IL10 (inflammatory chemokines and cytokines) 분비를 ELISA로 측정했습니다
(b) 배양 배지에서 TGFB2 분비를 ELISA로 측정했습니다
(c) IncuCyte 로 측정한 결과입니다. 대식세포(MHS 세포) 와 전이성 세포 K7M3 의 엑소좀 배양 배지에 TGFB2 를 실험구로 추가했습니다.
12시간에서 식세포 활성 (phagocytic activity) 의 상당한 억제(p < .05)가 관찰되었습니다
(d) IncuCyte 로 측정한 결과입니다. 대식세포(MHS 세포) 와 전이성 세포 DLM8 의 엑소좀 배양 배지에 TGFB2 를 실험구로 추가했습니다.
12시간에서 식세포 활성 (phagocytic activity) 의 상당한 억제(p < .05)가 관찰되었습니다
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