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Abstract
Stirred tank single-use bioreactors (SUB, 일회용 바이오리액터) 는 mammalian cell culture 를 이용하여 monoclonal antiboy 와 같은 바이오의약품
생산에 널리 사용되고 있다. 그러나 microbial fermentation 을 이용한 바이오의약품의 상업적 생산에는 SUB 가 널리 사용되지 않고 있다.
SUB 는 세척과 멸균에 소요되는 시간을 대폭 줄일 수 있으므로 high cell density microbial fermentation 공정에 SUB 를 효율적으로 사용할 수 있는
방법을 찾으면 생산량을 대폭 늘릴 수 있을것이다.
이 실험에서는 미생물배양을 위해 개발된 SUB 인 Biostat STR MO 를 이용하면 high cell density Escherichia coli 의 배양을 통해 recombinant protein 인
His-tagged protease inhibitor 의 생산이 매우 효율적으로 이루진다는 것을 테스트 하였다.
50 Liter scale SUB 에서 240 mmols/L/h 의 oxygen uptake rate (OUR) 가 가능하였다. 이 미생물 배양을 통해 5.8g/L 의 rProtein 과 60g/L 이상의 dry cell weight
를 얻을 수 있었다. 15L SIP stainless steel vessel (이하 SIP Vessel) 에서 이와 동일한 조건으로 배양한 결과와 비교하였을 때 SUB 에서의 결과와 아주 유사하다는 것을 확인할 수 있었다.
이를 통해 우리는 stirred tank SUB system 을 이용하면 high cell density 미생물 배양을 pilot scale 로 진행할 수 있으며 또한 임상에 사용될 수 있는 rProtein 의
생산에 필요한 시간과 비용을 대폭 줄일 수 있다는 것을 확인할 수 있었다.
Introduction
과거 수십년간 stirred single-use bioreactor (SUB) 는 동물세포의 상업적인 세포배양을 위해 많은 발전을 거듭해왔으며 특히 monoclonal antibody 생산에 많이 사용되어왔다.
2013년 이후에는 이러한 SUB 는 바이오제약회사 및 위탁개발회사 (CDMO) 의 필수적인 기술되었다. Stainless steel vessel 에 비해 일회용 bioreactor 는
복잡한 고정식 배관에 비해 설치가 쉽고 빠르며 투자비용도 적게 들고, product 가 오염되는 가능성이 극히 적어 CIP, SIP 작업이 필요치 않아 현재 널리 사용되고 있다.
비록 stirred tank 일회용 bioreactor (SUB) 가 동물세포의 배양에 널리 사용되고 있으나 미생물의 fermentation 공정에는 많이 사용되고 있지는 않는데
이는 미생물의 성장속도가 매우 빠르고 배양시 동물세포보다 20 - 75 배나 더 많은 열을 발생시키고 더 많은 전력이 필요하고 또한 더 많은 gas flow rate 를 필요로 하기 때문에
대형의 SUB 를 이용해 상업적인 대용량 미생물 발효를 진행하기가 어려운 점이 많았기 때문이다.
이 article 에서는 우리가 개발한 미생물 발효에 최적화된 stirred tank SUB 에서 50 Liter 의 규모의 soluble recombinant protein 을 생산하는 고밀도
Escherichia coli (E. coli) 발효 공정에 관해 설명하고자 한다.
우리는 이 발효 공정의 성능을 15 Liter SIP vessel 에서 동일한 조건에서 진행된 미생물 발효공정의 performance 와 비교하였다.
Materials & Methods
Cell Line and Media
pAVEwayTM expression system 을 이용하여 recombinant E.coli K12 strain 에서 His-tagged protease inhibitor 를 생산하였다. 이 expression system 은 다양한
단백질 치료제 생산에 널리 사용되고 있어 이 system 을 사용하였다. K12 세포는 pAVEway™ expression system 에 최적화된 항생물질이 없는 growth medium 에서 배양하였다.
Single-Use Bioreactor
high cell density 발효공정에 최적화된 일회용 Fexsafe STR MO bag (Sartorius) 을 장착하는 Biostat STR bioreactor (Sartorius) 를 사용하였다.
SUB 발효에 사용되는 culture bag 에는 6-blade rushton impeller 가 두 개, disk ring sparger, 6개의 feed lines, 하나의 dip 등이 장착되어있다.
그리고 여기에는 pH, DO, foam control, pressure 등을 측정하는 다양한 일회용 센서가 장착되어있다.
Single-Use Bioreactor Setup (원문참조)
Analytical Equipment (원문참조)
Single-Use Bioreactor Operation (원문참조)
Proof of Concept Study
Performance Test Runs in SUB
장비의 성능을 테스트 하기 위해 두개의 E.coli fed-batch fermentation (media 초기 working volume : 36 L) 과정을 Flexsafe MO culture bag 가 장착된
50 L-scale Biostat STR MO SUB 에서 시행하였다.
SUB 테스트는 2 번 시행했는데 Run1 과 Run2 는 media feeding 과 induction point 만 다르고 나머지 공정은 동일하였다.
SUB 발효 테스트에 대한 control 로서 SIP 에서 하는 SIP control 발효를 2 번 시행하였다.
이 모든 과정은 Batch Phase (incoluation production) 와 Fed-Batch Phase (fermentation) 두개의 과정으로 진행되었다.
SUB Test Run 1
Nutrient feed 는 발효공정동안 11g feed/L/h 의 정해진 속도로 투입하였으며 배양액을 넣은 후 1.5시간 후에 단백질 발현을 유도하였다. 총 배양 시간은 27시간이었다.
배양을 마친 후 배양물은 즉시 2시간안에 10℃ 이하로 냉각하였으며 그리고 harvest 하였다.
SUB Test Run 2
이 배양에서 nutrient feed 는 초기 11g feed/L/h 의 속도에서 출발하여 4시간동안 0.15/h 비율로 nutrient feed 의 feed rate 를 기하급수적으로 증가하여 투입하였다.
그리고 단백질 발현을 유도하였으며 medium 의 투입은 18g feed/L/h 의 고정 비율로 공급하였다. 총 배양시간은 32시간이었으며 Test Run 1 에서와 같은 방법으로 harvest 하였다.
Control Runs
두개의 SUB test 발효공정과 동시에 두개의 control fed-batch 발효 (initial working volume 12L) 를 15L-scale Biostat C stainless steel SIP fermenter vessel 에서 진행하였는데
이 두 vessel 은 전체 부피는 동일하나 높이와 직경에서 약간 차이가 있다. Control Run 1 의 배양 조건은 SUB Test Run 1 과 동일하였으며 Control Run 2 의 배양 조건은 SUB Test Run 2 와 동일하였다.
Analytical Methods (원문참조)
Results and Discussion
Temperature and pH Control in SUB Test Runs
Test Run 1 은 27시간, Test Run 2 는 32시간의 배양을 진행하였으나 각각의 온도는 37℃ 로 매우 일정하게 유지되었다. (Figure 4)
SUB Test Run 두개 모두 배양 기간동안 pH 의 변화가 설정값에서 0.02 unit 정도의 매우 작은 편차만 보일 정도로 유지가 매우 잘 되었다. (Figure 5)
Dissolved Oxygen Control in SUB Test Runs
SUB Test Run 는 impeller 의 agitation rate 를 변화시켜 30% 로 설정된 용존산소량 (DOT) 으로 조절하게 되는데 Figure 6 에서 보는 것처럼 SUB Test 발효 전 과정을 통해 DOT 가 잘
조절된다는 것을 알 수 있다. 발효시작 후 11시간에 oxygen enrichment 를 진행하였는데 DOT 의 변동이 심하게 일어났다는 것을 확인하였다.
SUB Test 공정에 사용된 oxygen enrichment 의 최고 level 은 57% 였으며 총 gas flow 는 60 L/min 이었다. (Figure 7)
Comparison of SUB Test Runs with Control Fermentations
Oxygen Uptake, Cell Density and Dry Weight
Batch phase 동안 SUB Test Run 의 OUR (oxygen uptake rate, 산소소모율) 는 240 mmoles/L/h 로서 SIP Control Run 의 251 mmoles/L/h 값과 유사하였다. (Figure 8 and Table 1)
Fed-batch fermentation 동안 SUB test run 의 OD600 (optical density) 은 200 으로서 높은 cell density 를 보였으며 (Figure 9) dry cell weight 도 > 60 g/L 으로서 높은 biomass 를 나타냈다. (Figure 10).
2개의 SUB test run 의 OD600 과 dry cell weight 의 growth profile 은 2개의 control run 과 매우 유사하였다. (Figure 9 and 10).
이 결과로부터 우리는 SUB 를 이용하는 fed-batch fermentation 의 dry cell weight 생산 능력은 전통적인 SIP vessel 을 이용하는 fermentation 결과와 매우 유사하다는 것을 알 수 있었다.
Protein Titer
Table 2 에서 우리는 SUB test 발효에서 생산된 재조합 Hi-tagged protease inhibitor 단백질의 titer 는 SIP control 발효 vessel 에서 생산된 단백질의 titer 와
매우 유사하다는 것을 알 수 있다.
Run 2 에서는 SUB Test 와 SIP Control 모두 Run 1 에 비해 30% 이상 더 많은 단백질을 생산하였다.
이 결과에서 우리는 SUB Test 는 high cell density E.coli 발효공정을 이용한 치료용 단백질 생산에 매우 적합하다는 것을 알 수 있다.
Conclusions
SUB (single-use bioreactor vessel) 는 SIP 발효 vessel 에 비해 설치가 빠르고 SIP vessel 과 동일한 발효 성능을 나타내었다.
SUB 는 mixing, mass transfer, high gas flow rate 가 충분하였으며 또한 fermentation 과정에 발생하는 온도를 매우 효과적으로 조절하였다.
요약하면 Biostat STR MO SUB system 과 E.coli pAVEway strain 을 이용하는 발효 공정은 His-tagged protease inhibitor 단백질을 생산하는데 매우 효과적이며
특히 SUB 는 SIP vessel 을 이용하는 기존의 high cell density 발효공정을 충분히 대체하여 생산 비용과 시간을 대폭 줄일 수 있는 방법이다.
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