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Introduction
Recombinant protein 생산에 사용되는 E. coli 는 K12, DH5, TG1, W3110, , B834, BL21, TKB1 과 같이 매우 다양한 strain 이 사용되고 있다.
E.coli 를 생산용으로 배양하기 위해서는 배양액을 yeast extract 와 같은 이른바 complex medium 을 사용하는 것 보다 잘 알려진 성분으로 구성된
defined medium 에서 fed-batch 방식으로 배양하는 것이 high cell density cultivation 에 이롭고 또한 더 많은 product 의 생산이 가능하다.
이번 연구에서는 small scale bioreactor 를 이용하여 소-중형 용량의 rProtein 을 생산하기에 매우 편리한 batch cultivation 공정을 개발하고자 한다.
Material & Methods
Reporter gene 인 GFP (green fluorescence protein) 유전자를 가지고 있는 E.coli BL21 을 이용하였으며 이의 배양 조건은 다음과 같다.
Composition of Defined Medium
seed culture 는 defined mineral salt medium (Korz et al. 1995) 을 이용하였다.
Composition of Complex Medium
batch cultivation 은 다음 성분으로 이루어진 complex media 를 이용하였다.
- glucose : 36 g/L - yeast extract : 60 g/L
Seed Culture Preparation
E.coli 를 defined mineral salt medium 에서 OD600 = 120 이 될 때까지 high cell density cultivation 을 하여 seed culture 를 준비하였다.
seed culture 를 20℃ 까지 cooling 한 후 15% glycerol (w/v) 을 넣어 OD600 가 약 100 정도가 되도록 하여 50ml tube 에 45ml 씩 분주하여 -80℃ 에서 보관하였다.
Batch Cultivation
seed culture 를 해동한 다음 5,500 x g 에서 15분동안 원심분리 한 다음 50ml sterile complex media 에서 resuspend 하였다.
이것을 2L complex medium 이 들어있는 2L ouble wall UniVessel bioreactor 에 넣고 배양을 시작하였다. 이 때의 bioreactor 배양 조건은 다음과 같다.
- 온도 : 36℃
- two 6-blade rushton impeller with 74mm distance located 10mm above the sparger
- no pH control
- Dissolved oxygen concentration (DO) : 30%
- DO is controlled by increasing agitation speed (500 - 2,000rpm)
- if O2-enrichment 가 필요할 경우 ring sparger 를 통해 2L/min 의 constant air flow
- BIOSTAT® B control tower 를 이용하여 전체 공정을 control
- batch culture 의 OD600 이 19±2 가 되는 시점에 2, 6, 10 g/L 의 L-arabinose 를 첨가하여 rGFP 의 생산을 유도하였다.
Results
시간에 따른 culture 의 optical density, pH, pO2%, agitation speed 의 변화 그리고 inducer 로 사용되는 2g/L L-arabinose 를 Figure 1 에 표시하였다.
Figure 1 : Batch cultivation of E. coli BL21 in glucose enriched complex medium. Time course of optical density, pH, Do and agitation speed are shown.
DO 는 agitation speed 를 조절하는 방식으로 30% DO 를 유지하였다.
그러나 배양 2시간 후 L-arabinose 를 첨가하여 protein 생산을 유도하면 배양액 내 DO 양이 부족해지게 되는데
이 때 (배양 후 3.3 ~ 3.5 시간) oxygen 을 별도 공급하여 30% DO 를 유지하였다.
inoculation 을 한 배양 초기의 pH 는 6.9 이었으나 배양이 진행되면서 세포로부터 산성의 대사산물이 만들어지고 염기성 배양성분이 소모됨에 따라
pH 가 5.3 으로 떨어졌다. 그러나 이것은 BL21 E.coli 에게는 크게 영향을 끼치지 않는다.
inoculation 이후에 세포는 specific growth rate 가 1.1 h-1 정도로 기하급수적으로 자랐다. 배양 2시간 후 세포의 optical density 는 OD = 19 ± 2 에 도달하였으며
이때 L-arabinose 를 첨가하여 recombinant protein 발현을 유도하였다.
그 후 세포는 1.5 시간동안 0.5 h-1 specific growth rate 로 성장하다가 총 7시간 배양 후에 최종 OD 값이 약 56이 되는 시점에 세포 성장을 멈추었다.
Figure 2 : GFP concentration after induction with 2 g/L □,
6 g/L ○, 10 g/L △
Inductor 로 사용되는 L-arabinose 의 농도를 2g, 6g, 10g / L 로 달리한 결과 세포가 생산한 rGFP protein 의 최종 농도는 0.5, 0.6, 0.8 g/L 로 역시 증가하였다.
Summary
BIOSTAT® B bioreactor 를 이용한 E.coli 세포의 배양과 recombinant protein 의 생산은 매우 편리하였다. 2개의 성분으로 이루어진 배양액에서 pH 조절 장치도 없이
OD600 값이 약 56의 cell density 를 가진 세포 배양이 가능하였다.
OD600 값이 약 20 되는 시점에 다양한 농도의 L-arabinose 를 첨가하여 GFP 생산을 유도할 수 있었다.
그리고 induction 후 2~3 시간만에 0.5 ~ 0.8 g GFP/L 를 생산하였다.
이러한 결과를 통해 우리는 BIOSTAT® B bioreactor 에서 pH 와 feed 를 control 하여 세포를 배양한다면 더 간단한 media 를 이용하여도 더 많은 수의 세포와
더 많은 단백질을 생산할 수 있을 것이라는 것을 알 수 있었다.
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