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Purpose
이 application note 는 Sartorius BIOSTAT® 2L single-use Univessel 배양기에서 human adipose-derived mesenchymal stem cells (hAD-MSC) 세포를 microcarrier 에서
cell expansion 할 때의 배양조건과 설정값에 설명하고자 한다.
일반적으로 이러한 배양조건은 50 Liter 이상까지 scale up 하여 배양할 수 있다.
신뢰성이 있으며 또한 scale up 도 가능한 cell expansion 방법은 MSC 세포를
치료제로 사용하는데 매우 중요한 내용이다.
Introduction
human mesenchymal stem cells (MSC) 세포를 임상학적 및 재생의학적으로 사용하는 빈도가 증가함에 따라 건강한 상태의 MSC 세포를 대량으로 필요하게 되었다.
자가이식 치료를 위해서는 일회투여하는데 최소 5 x 10^8 cell 이 필요하다.
그리고 MSC 세포는 CellSTACK 과 같은 multi-layer flask 를 이용하여 배양하는 것 보다 실험용 일회용 stirred bioreactor 에서 microcarrier 를 이용하는 것이 훨씬 더 배양이 잘 된다.
Medium, Methods & Equipment
Overview of set-up procedure
| Day -1 : |
microcarrier bead 인 Sartorius SoloHill Pronectin F 를 전체 배양액의
0.75% (solid fraction) 농도로 미리 준비한다. |
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| Day 0 : |
준비한 UniVessel SU bioreactor 에 microcarrier 를 넣고 MSC 배양액을
0.7 Liter 채운다. 그리고 4시간동안 bioreactor 에 장착된 pH & DO 센서를 equilibration 한다.
냉동되어 있는 MSC 세포를 녹인 후 seeding density 가 1.5 x 10^7 가
되도록 준비한 후 bioreactor 에 넣고 이 세포들이 microcarrier 에
붙을 수 있도록 agitation 없이 4시간 동안 그대로 둔다.
그 후 bioreactor 의 media 양을 총 2 Liter 로 맞추고 100rpm 의 속도로 agitation 을 시작한다. |
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| Day 4 : |
bioreactor 안의 배양액 50% 를 fresh media 로 교체한다. |
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| Day 7 : |
enzymatic cell detachment => cell resuspension => vialing => freezing 의
순서로 microcarrier 에 붙어있는 MSC 세포를 분리한다. |
Cells, Medium and Microcarrier
초기 seeding 하는데 사용한 1.5 x 10^7 cell 은 serum-reduced 5% FBS media 에서 배양하였다. SoloHill Pronectin F microcarrier (0.75% solid fraction) 은 제조사 권장 방법으로 준비하였다.
Cultivation setup
다음은 UniVessel Su 에서 MSC 세포를 cultivation 하는 3가지 과정이다.
(1) initial cell attachment (2) cell expansion (3) cell harvest
Microcarrier 와 0.7Liter 배양액을 UniVessel SU bioreactor 에 넣고 37℃,
5% CO₂, 85 rpm 의 조건에서 4시간동안 equilibration 한다.
그 후 해동한 MSC 세포를 초기 density 가 2.8 x 10^3 cells/cm² 가 되도록
넣어주고 4시간동안 agitation 없이 그대로 방치하여 세포가 microcarrier 에
attachment 하도록 한다.
UniVessel SU vessel 의 배양액이 총 2 Liter 가 되도록 배양액을 채워준다.
초기에는 impeller 의 speed 를 100rpm 으로 시작하고 배양이 진행됨에 따라
최대 135rpm 으로 올려준다.
MSC 세포는 37℃, pH 7.2 그리고 0.1 vvm (gas volume flow per unit of liquid
volume per minute) 조건에서 7일 동안 배양하였다.
배양 4일째에 (cell density 가 약 2 - 3 x 10^4 cells/cm²) 영양부족을 방지하기
위해 vessel 내 배양액 50% 를 새 배양액으로 교체하여 준다.
cell density 가 최대에 도달하였을 때 (배양 7일째) enzymatic cell detachment
와 washing 단계를 통해 세포를 microcarrier 와 분리한다.
microcarrier 가 제거된 배양액을 2000g 에서 8분간 원심분리하여 MSC 세포를
분리한다.
Cultivation conditions
- working volume : 2 L
- Microcarrier concentration : 0.75% microcarrier soilid fraction
- Inoculated cell number : 1.5 x 10^7 MSC
- Agitation speed : between 100rpm (below NS1u) and 135rpm(NS1)
- Temperature : 37℃
- Head aeration : 0.1 vvm
- Dissolved oxygen (DO) : > 20%
- Cultivation time : 7 days
Results
Figure 2 A 는 UniVessel SU bioreactor 와 control spinner flask 에서 나타나는
시간에 따른 전형적인 cell growth type 이다.
7일간 expansion 후 MSC 세포의 총 개수는 5.3±0.5 x 10^8 으로서 초기
inoculation 한 세포수 1.5 x 10^7 에 비해 세포가 늘어난 expansion factor 는
약 35.4 ± 0.4 가 되고 doubling time 은 약 25.6 ± 0.2 hour 가 된다.
배양 3일까지 세포는 lag phase 상태에 있었으며 이후 7일까지 exponential
growth phase 가 이어졌다.
배양 4일째에 배양액중 50% 새것으로 교환하였다.
배양 7일째에 세포를 harvest 하기 직전에 DAPI staining 을 시시하여 관찰한
결과 모든 microcarrier 가 세포에 완전히 둘러쌓여 있었으며 그 aggregates 의
직경은 약 2mm 정도였다.
Trypsin EDTA 를 이용하여 세포와 microcarrier 를 분리한 후 세포를 harvest
하였으며 harvest rate 는 > 98%, cell viability 는 98% 이었다.
Conclusion
이 실험을 통해 UniVessel Su bioreactor 는 microcarrier 를 이용하는 adipose-derived MSC 의 expansion 에 매우 적합하였으며
특히 자가 세포 치료제 (autlogous cell therapy) 에 가장 적절한 일회 투여 용량인 5 x 10^8 을 생산하는데 매우 유용하다는 것을
알 수 있었다.
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