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- Reference : AOAC 998.05 Non-casein Nitrogen Content of Milk;
AOAC 991.21 Non-protein Nitrogen in Whole Milk;
AOAC 991.20 Nitrogen (Total) in Milk;
ISO 8968 - 4 FIL 20 - 4 : 2001 Non-protein Nitrogen content
- Tested with VELP Scientifica DKL 20 Automatic Kjeldahl Digestion Unit
(Code S30100210) and UDK 159 Automatic Kjeldahl Distillation & Titration
System (Code F30200150) |
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Introduction
우유의 질소 함량은 크게 카제인 질소 (casein nitrogen, CN) 와 비 카제인 질소 (non-casein nitrogen, NCN)
로 나뉘어 진다. 비 카제인 질소 중 요소 및 기타 저 분자량 화합물로 구성된 가용성 유청 단백질 (whey protein, WP),
효소 및 비 단백태 질소 물질 (non-protein nitrogen, NPN) 으로 구성한다. 특히 유청 단백질 함량은 우유의 신선도를
판단할 때 사용되는 데, 그 값이 15.5%를 넘지 않도록 관리하고 있다.
유청 단백질 함량을 계산하기 위해서는 먼저 우유의 총 질소 값, NCN, NPN 을 확인하고, 최종적으로
NCN에서 NPN 값을 빼주는 식으로 산출되어 진다.
킬달 단백질 함량 분석법은 샘플에 황산을 넣고 400 ℃ 이상의 고온에서 가열하여 샘플에 유기적으로 결합되어 있던 질소를
황산암모늄염으로 변환하는 단계에서부터 시작한다 (1. Digestion, 분해 단계). 황산암모늄염에 알칼리용액을 첨가하면 질소가
암모니아 가스로서 유리되어 붕산으로 포집되고 (2. Distillation, 증류 단계), 이러한 암모늄염이 포집된 용액을 염산 혹은 황산
표준 용액으로 적정하여 질소의 함량을 계산한다 (3. Titration, 적정 단계).
그러나 1. Digestion, 분해 단계에서 다량의 산성 유독가스가 발생하고, 2. Digestion, 증류 단계에서 복잡한 시험법으로 인해
사용자에 따라 오차가 발생하기 쉽고, 3. Titration, 적정 단계에서 얻은 결과를 별도로 계산하여 단백질 값으로 환산해야 하는 단점이 있다.
VELP 사 킬달 단백질 함량 분석 장비는 위 단점을 해결하여 쉽고, 안전하고, 신뢰성 있는 실험을 가능케한다.
이 시험에서는 VELP DKL 20 Automatic Kjeldahl Digestion Unit (Code S30100210), UDK 159 Automatic Kjeldahl Analyzer 로 우유의 유청 단백질 함량을 확인하였다.
시험 방법
- 시료 : 시유 (멸균 및 포장이 완료된 시판 우유)
protein labeled value : 3.35%
whey proteins content from literature : not less than 15.5%
Digestion Process
- 20 mL 의 우유를 50 mL 정량 플라스크에 넣고 20 mL 의 증류수를 넣는다.
- 정량플라스크를 37 ℃ 의 open circulating bath 에 넣고 30분간 방치한다.
- 10% 아세트산 용액 2 mL 를 넣고 잘 섞은 후 10 분간 방치한다.
- 응고되어 침전된 카제인을 filter paper 를 사용하여 여과하고, filter paper 및 카제인 단백질
응고물을 시험관에 넣는다.
- 다시 20 mL 의 우유를 50 mL 정량 플라스크에 넣고 20% tricloracetic acid 용액을 30 mL
넣고 30분간 방치한다.
- 응고되어 침전된 유청 단백질을 filter paper 를 사용하여 여과하고, filter paper 및 유청 단백질
응고물을 시험관에 넣는다.
- 이 단계까지 총 2가지의 시험관이 준비되었고, 다음을 샘플이 담긴 각 시험관에 넣는다.
* 2 catalyst tablet CM (code CT0006650; 3.5 g K2SO4, 0.1 g CuSO4)
* 4 antifoam tablets S (code CT0006600)
* 5 mL 30% hydrogen peroxide
* 15 mL 96 ~ 98% concentrated sulphuric acid
- Blank 시험용 시험관 (샘플을 제외한 나머지 물질을 넣은 시험관) 을 준비한다.
- Digestion Unit을 Fume Neutralization System (SMS Scrubber code F307C0199) 및
Aspiration Pump (JP code F30620198) 에 연결하여 분해 시작 전 미리 펌프를
작동시켜둔다.
- 다음 조건을 설정하고 분해를 시작한다.
150 ℃, 15 min → 200 ℃, 45 min → 300 ℃, 15 min → 420 ℃, 60 min
- 분해가 완료되면 시험관이 자동으로 상승하여 공기중에 냉각이 시작된다.
시험관의 온도가 50~60 ℃ 가 될 때까지 냉각한다.
Distillation and Titration
- Wash down 기능을 3 ~ 5회 실행하여 장비 내부를 세척하고, 증류 발생장치를 예열한다.
- 장비에 내재된 프로그램 1번 방법 (아래) 을 선택하고 증류를 시작한다.
* H2O (희석수): 50 mL
* H2SO4 (0.1 N, 적정 용액)
* NaOH (32 %): 70 mL
* 질소계수: 6.38
* H3BO3 (4 %, 지시약 포함): 30 mL
- 증류 및 적정 분석 시간: 샘플 당 약 4분 소요
시험 결과
Non-casein nitrogen (NCN) 은 다음의 수식을 통해 계산하였다.
NCN% = mg N / [(G milk/V sol) x 1000 x V filtrate] x 100
G milk = milk weight (20 g)
V sol = milk solution containing all the chemicals necessary for separating,
filled up to volume (50 ml)
V filtrate= filtrate used to perform 1 analysis (ml)
* 계산된 값은 우유의 지방 함량을 고려하여 보정계수 0.994 를 곱한다.
Non-protein nitrogen (NPN) 은 다음의 수식을 통해 계산하였다.
NPN% = mg N / [(G milk/V sol) x 1000 x V filtrate] x 100
G milk = milk weight (20 g)
V sol = milk solution containing all the chemicals necessary for separating,
filled up to volume (50 ml)
V filtrate= filtrate used to perform 1 analysis (ml)
Whey Protein (WP) 은 다음의 수식을 통해 계산하였다.
WP% = (NCN - NPN)/Ntot x 100
- NCN 및 NPN 값의 상대표준편차가 모두 1% 미만으로 확인되어 재현성 있는 결과임을 알 수
있다.
- NCN 및 NPN 값을 통해 최종적으로 확인한 유청 단백질 함량은 15.8% 이므로 신선한 우유의
값인 15.5% 보다 약간 더 높은 값을 가지는 제품임을 판단할 수 있다.
- Verification test : 장비 성능테스트를 위해 5 mL 에 28 mg 의 질소를 함유하는 시약으로
알려진 3% glycine standard solution 을 분석하였다. 그 결과, 98 ~ 102% 사이의 recovery
범위 내 값을
확인하였고, 이는 장비 성능이 유지된 채 분석이 진행되었음을 의미한다.
- 우유의 유청 단백질 함량 분석에 DKL 20 및 UDK 159 가 적합하였다.
VELP 사 DKL 및 UDK 킬달 단백질 함량 분석 장비를 사용하면 다음의 이점이 있다.
DKL digestion unit
- 최대 450 ℃ 까지 빠른 가열 속도 구현
- scrubber 를 통해 분해 시 발생한 산성 유독가스의 중화
- 54개 프로그램 사용 가능 (30 pre-installed + 24 user-programmable)
- 자동 lift 적용 모델은 분해 종료 직후 고온의 시험관을 자동으로 상승하여 안전하고 편리하게
냉각 가능
UDK distillation unit
- 프로그래밍이 가능하여 시약의 주입, 중화, 증류, 잔류물 제거, 세척 단계가 자동으로 진행된다.
- 증류 정도를 10~100% 범위에서 조절 가능
- 55개 프로그램 사용 가능 (31 pre-installed + 24 user-programmable)
- 자동 적정 및 질소/단백질량 자동 계산
- USB 로 데이터 로깅 (Excel file)
- 높은 수준의 정밀도와 재현성
- 최대 생산성 및 완전 자동화
- AOAC method 적용
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