| Phone |
| |
| |
| 대표전화 |
1577-7956 |
| 본 사 |
031-457-9187 |
| 대 전 |
042-932-1265 |
| |
|
| Web Site Visitors |
| |
| |
| Today |
939 |
| Yesterday |
1404 |
| Since 2006 |
2,700,091 |
| |
|
|
|
| ■ |
Particle Sizing with Dry Dispersion Can Be the Best Choice for Pharmaceutical Analysis |
 |
David Pugh
Business Consultant at Bettersize Instruments Ltd.
Email: dpugh9486@gmail.com
David Pugh has been involved in gas, liquid, surface area and particle size analysis for over 30 years.
Currently, his main expertise is in particle size analysis of suspensions and dispersions,
as well as dry analysis of numerous commercial products, especially in the pharmaceutical and biotechnology sectors.
|
Abstract
이 논문은 레이저 회절 기술을 다루며, 이 기술이 처음 고안되었을 당시 적절한 희석제로 샘플을 희석한 후 혼합물을 샘플 측정 셀을 통해 펌핑하여 입자 크기를
측정했던 방식에 대해 설명합니다. 논문은 용매 사용에서 벗어나 건식 측정을 활용하게 된 과정을 다루며, 건식 측정 방식의 장애물은 무엇이었는지,
그리고 25년 동안 이를 어떻게 극복했는지를 설명합니다.
제약용 분말은 일반적으로 입자 과학자가 접하게 되는 가장 응집력이 강한 물질로 간주되며, 습식 방법을 사용할 때 매우 까다로운 경우가 많습니다.
본 논문에서는 현대의 건식 레이저 회절 기술이 이러한 응집성 샘플을 어떻게 분석하고, 더욱 친환경적인 방법으로 신뢰할 수 있고 재현 가능한 결과를 도출할 수 있는지를 보여줍니다.
Introduction
1974년에 입자 크기를 더 빠르게 측정하기 위해 레이저 광 회절 분석이 처음 도입되었을 때, 습식 분산 방식만 사용 가능했습니다.
이듬해인 1975년에 건식 시료 분석이 도입되었지만, 측정 대상 제품의 대부분이 건조 상태임에도 불구하고 대부분의 응용 분야는 습식으로 측정되었습니다.
초기에는 시멘트조차도 대부분 알코올에서 정확하게 측정되었으며, 물에서는 부정확하게 측정되었습니다.
그런데 왜 많은 샘플이 여러 문제를 극복해야만 정확하고 재현 가능한 결과를 얻을 수 있었음에도 불구하고 습식으로 측정되었을까요?
실험실 기술자들이 물에서 용해되거나 응집되는 샘플을 다루며 직면한 문제들을 살펴보겠습니다.
첫 번째로, 샘플이 용해되지 않으면서 분산될 수 있는 용매를 찾아야 했습니다. 문제는 이러한 용매 중 다수가 독성이 있고, 구매 및 친환경적으로 폐기하는 비용이 비쌌다는 점입니다.
제가 개인적으로 경험한 예로는 초콜릿이 Genklene (1,1,1 - Trichloroethane) 에 분산된 후 초음파를 30초간 사용해 분산을 완료한 뒤 분석된 경우가 있습니다.
그러나 Genklene 의 독성 (발암성) 때문에 사용자 안전 문제로 인해 사용이 중단되었으며, 국제적으로도 온실가스 배출 규정에 따라 단계적으로 퇴출되었습니다.
두 번째로, 물에 분산되었을 때 샘플이 응집되는 경우 이를 방지할 방법을 찾아야 했습니다.
첫째, 분산제 표면에 주로 미세 물질이 나타나는 경우, 표면 장력을 줄이기 위해 적합한 계면활성제를 찾아야 했습니다.
선택 가능한 계면활성제는 비이온성, 음이온성, 양이온성, 양쪽성 네 가지 중 하나였습니다.
둘째, 물에서 미세 입자가 응집되는 문제를 해결하기 위해 적절한 혼합 첨가제를 선택하여 물에 추가해야 했습니다.
입자의 제타 전위는 pH 에 따라 변화하는 것으로 알려져 있습니다. 예를 들어, pH 3 에서는 제타 전위가 +30mV, pH 10 에서는 -25mV 로 매우 안정적이어서 응집이 예상되지 않지만,
pH 6에서는 제타 전위가 0mV (등전점) 에 도달하며 최대 응집이 발생할 가능성이 높습니다.
이 경우, 과대하게 부정확한 결과가 나올 수 있습니다.
이러한 모든 요소를 고려해야 했기 때문에, 많은 표준 작업 절차 (SOP) 가 오류가 있는 결과를 산출하거나 동일한 SOP 를 사용하더라도 각 작업자가 해석하는 방식에 따라 상이한 결과를
초래하는 것은 놀라운 일이 아닙니다.
The gradual change from wet to dry measurement.
지난 30년 동안 건식 입자 크기 분석은 점점 더 널리 사용되었으며, 특히 제약 산업에서는 이전에 특이한 용매를 사용하여 API (활성 제약 성분) 를 분산시키되
제형이 용해되지 않도록 하는 방식이 일반적이었습니다.
그동안 어떤 변화가 있었을까요? 광물, 시멘트, 분체 코팅과 같은 산업은 초기에는 습식으로 측정했으나 지난 30~40년 동안 자사의 제품을 전적으로 건식으로 측정해왔습니다.
주요 이유는 이들 응용 분야가 건식으로 측정할 때, 심지어 초기의 건식 분말 공급 장치 설계로도 상대적으로 항상 쉬웠기 때문입니다.
이러한 설계가 점진적으로 개선됨에 따라, 제약 산업을 포함한 다른 산업도 더 빠르고 친환경적이며,
더 많은 샘플을 사용함으로써 통계적으로 더 정확한 결과를 제공하는 이 방법을 활용할 수 있게 되었습니다.
Improvements in Dry Powder Feeder Design.
Feed Control
초기 설계를 살펴보고 더 정확하고 재현 가능한 결과를 제공하기 위해 어떤 개선이 이루어졌는지 알아보겠습니다.
초기에는 샘플을 중력에 의해 분산 구역으로 이동시키는 방식이 사용되었습니다. 샘플을 깔때기에 부으면 깔때기 아래에 위치한 분산 구역으로 샘플이 떨어졌고,
그곳에서 공기 제트가 샘플에 충돌하여 분산시켰습니다. 이를 통해 이론적으로 대표성을 가진 결과를 측정 셀에 전달하도록 설계되었습니다.
하지만 주요 결함은 샘플을 대량으로 공급하는 방식이 제어된 공급이 아니었기 때문에, 응집성이 없는 샘플에 대해서만 건식 입자 측정 결과를 제공할 수 있다는 점이었습니다.
이 방식은 대체로 수분이 거의 없거나 없는 큰 크기의 입자를 선호하며, 제약 산업에서 주로 생산되는 훨씬 더 미세하고 응집성이 강한 샘플에는 적합하지 않았습니다.
다음으로 개발된 방식은 샘플을 진동 트레이를 통해 깔때기로 전달한 후, 다시 중력에 의해 분산 구역으로 떨어뜨리는 방식이었습니다.
이 방법에는 두 가지 문제가 있었습니다. 첫째, 특히 응집성 분말의 경우, 진동 트레이를 통해 이동하는 동안 농도가 달라질 수 있어 분산기로 전달되는 샘플이 너무 많거나
너무 적은 경우가 있었습니다. 즉, 샘플이 과잉 공급되거나 부족한 상황(풍족하거나 부족한 상태)이 발생할 수 있었습니다.
응집성 샘플이 한꺼번에 너무 많이 도착하면, 초기의 공기 분산기가 샘플이 공기와 밀접하게 접촉하는 순간에 모든 샘플을 분산시키기에
충분히 효율적이지 않을 가능성이 항상 있었습니다. 이는 미세하게 분산된 입자 분포와 분산되지 않은 입자가 섞인 상태를 초래할 수 있었습니다.
또한, 작업자가 대표성을 가진 샘플을 얻더라도 모든 샘플이 측정에 사용되지 않을 수 있었습니다. 일부 샘플은 진동 트레이에 남아 있을 수 있었고,
이와 더불어 타이밍 문제도 존재했습니다. 샘플이 진동 트레이를 따라 내려가는 동안, 작업자가 샘플 셀을 통과하는 샘플 농도가 유효한 측정값을 제공할 만큼 충분히 높다고 판단할 때만
측정 명령이 활성화되었습니다. 게다가 실행 시간이 미리 설정되어 있어, 샘플이 일찍 소진되면 신호 대 잡음비가 급격히 감소하여 측정값이 아닌 잡음만 측정될 수 있었습니다.
반대로 샘플이 너무 많으면 실행 시간이 끝날 때까지 모든 샘플을 측정하지 못하는 문제가 있었습니다.
Computer Software Control
이 문제는 1980년대 후반에서 1990년대 초반에 걸쳐 컴퓨터와 시스템 소프트웨어의 발전으로 결국 해결되었습니다.
소프트웨어에 차광 트리거링 (obscuration triggering) 이라는 필터링 기술이 도입되었습니다. 작업자는 언제든지 측정/실행 버튼을 누를 수 있었지만,
특정 사전 설정된 최소 차광 수준에 도달할 때까지는 샘플 스윕이 시작되지 않았고, 이 수준에 도달하면 작업자가 추가로 조작할 필요 없이 실제 데이터 수집이 시작되었습니다.
뿐만 아니라, 샘플의 마지막 부분이 측정 구역을 통과하며 사전 설정된 최소 차광 수준 아래로 떨어지면 데이터 수집이 자동으로 중지되고 측정이 완료되었습니다.
이 방식의 장점은 샘플의 최소 99% 이상이 매우 높은 신호 대 잡음비로 측정된다는 점으로, 결과에 대한 높은 신뢰도를 제공합니다.
추가적으로, 샘플을 여러 번(일반적으로 3회) 반복 측정하고, 3회의 측정 결과를 완벽하게 겹쳐진 그래프로 비교하여 결과에 대한 확신을 더욱 강화할 수 있습니다.
Hardware changes that work
건식 분석의 측정을 개선하기 위해 필요한 하드웨어 변경 사항을 이해하려면 성공적인 건식 분석을 위한 전제 조건을 파악하는 것이 중요합니다.
샘플은 대표성을 가지며 공기 유도기에 전달되어야 하며, 이 유도기는 샘플을 분산시킵니다. 이후, 주로 입자 간 전단 (shear) 에 의한 추가 분산이 일정한 직경을 가진
튜브로 구성된 흐름 경로를 따라 진행됩니다. 이 튜브는 분산된 샘플을 측정 구역으로 운반하며, 이 측정 구역은 속도 편향을 방지하기 위해 밀폐된 샘플 셀이어야 합니다.
이 포괄적인 진술은 응집성 제약 분말을 정확하게 분석하려는 경우 반드시 충족해야 하는 세부 사항을 포함합니다.
첫째, 샘플 간 교차 오염은 최소화하거나 이상적으로는 완전히 없어야 하므로, 공급 트레이는 샘플이 들러붙지 않도록 설계되고 청소가 용이해야 합니다.
둘째, 트레이에 놓인 모든 샘플이 운반되고 분석되어야 합니다.
셋째, 응집체의 적절한 사전 분산이 이루어져야 하며, 이는 압력 적정 곡선을 통해 확인해야 합니다. 본질적으로 응집성 샘플은 분산되되, 분쇄되지 않아야 합니다.
샘플이 측정 셀로 전달되는 흐름 경로는 일정한 내경을 가져야 하며, 샘플 노즐은 내마모성 소재로 제작되어야 합니다.
측정 구역에 도달한 샘플은 밀폐된 셀에서 측정되어야 하며, 이때 가장 큰 입자와 가장 작은 입자가 동일한 속도로 이동해야 데이터에서 균등하게 대표될 수 있습니다.
일정한 직경의 흐름 경로와 밀폐된 측정 셀을 사용하는 것은 속도 편향을 없애는 핵심입니다.
이러한 하드웨어 요건이 충족되지 않으면 응집성 샘플의 경우 결과가 미세 입자 쪽으로 인위적으로 치우칠 위험이 항상 존재합니다.
Hardware changes that failed
일부 하드웨어 변경 사항은 위에서 언급한 기준을 충족하지 못해 결국 제안했던 레이저 회절 기업들에 의해 대부분 폐기되었습니다.
예를 들어, 회전 브러시를 사용한 사전 분산 방식은 샘플 분말을 분산시키는 데 사용되었으나, 이 기술은 브러시에 샘플이 남아 다음 분석 시 오염될 가능성을 초래하여
샘플 간 교차 오염 문제를 야기했습니다. 또한, 회전하는 부품이 사용되기 때문에 유지보수 관점에서 문제가 되었고, 평균 고장 시간(MTBF)이 단축되는 결과를 초래했습니다.
다른 하드웨어 개선 사례 중 일부는 여전히 사용되고 있습니다. 예를 들어, 노즐 출구 전에 배플(baffle) 형식을 사용하는 방식이 있습니다.
샘플이 함유된 공기가 배플에 부딪히면서 응집성의 깨지기 쉬운 결정성 입자가 파쇄되는데, 이 배플 방식은 제약 산업 (결정성 입자가 많은) 을 위해 설계된 것이 아니며,
실제 입자 크기보다 더 미세하게 분쇄된 결과를 초래합니다. 이는 실험실 기술자에게는 만족스러운 결과일 수 있지만, 환자에게는 적합하지 않을 수 있습니다.
진동을 이용해 볼베어링과 함께 체 (sieve) 를 사용해 샘플을 사전 분산시키는 방식도 처음에는 좋은 아이디어처럼 보였습니다.
하지만 응집성 물질을 이 방식으로 테스트한 결과, 샘플의 대부분이 체와 볼베어링 주변에 달라붙어 측정 구역에 도달하지 못하는 경우가 많았습니다.
이뿐만 아니라, 샘플이 슈트(chute)와 샘플 흐름 경로에 축적되어 측정값이 대표성을 갖지 못하는 문제도 발생했습니다.
따라서 제약 샘플을 측정할 때 결과의 신뢰성을 보장하려면 이 시스템의 전체 흐름 경로를 청소해야 합니다.
하지만 사용자들은 신속하고 반복 가능하며 정확한 결과를 기대하지, 번거로운 청소를 원하지 않기 때문에 이 시스템은 이상적이지 않습니다.
또한, 샘플을 밀링한 후 노즐의 직경이 넓어지는 구조를 통해 샘플을 배출하고, 이를 주변 공기 속으로 분사하여 속도 편향(velocity biasing) 이라는 불리한 현상을 일으키는
건식 분산 장치도 여전히 존재합니다. 이미 건식으로 측정되는 모든 샘플은 최소 4가지 서로 다른 압력에서 측정하는 압력 적정 분석 (pressure titration analysis) 을 거쳐야 한다고 권장되었습니다.
예를 들어, 모래나 분체 코팅과 같은 자유 유동 물질은 잘 설계된 건식 분말 공급 장치로 측정할 경우 모든 압력에서 동일한 크기의 결과를 제공합니다.
하지만 제약 샘플과 같은 응집성 물질의 경우, 0.5~4바 (Bar) 의 압력 범위에서 측정이 필요합니다. 이를 통해 탈응집 (deagglomeration) 이 발생하는 압력 범위,
분쇄가 발생하는 더 높은 압력 범위, 그리고 이 둘 사이에서 샘플이 밀링되지 않고 분산될 수 있는 작동 압력 범위를 확인할 수 있습니다.
이는 잘 설계된 건식 분말 분산 시스템을 사용하면 매우 짧은 시간 내에 가능합니다. 하지만 흐름 경로가 일정한 직경으로 유지되지 않고,
더 나쁜 경우, 샘플을 밀폐된 공기 셀이 아니라 주변 공기로 방출한 후 입자가 레이저를 통과하는 시스템은 심각한 문제를 초래합니다. 그 중 가장 큰 문제는 속도 편향 (velocity biasing) 입니다.
What is velocity biasing?
가장 큰 입자는 가장 큰 운동량을 가지며, 레이저 빔을 총알처럼 빠르게 통과합니다. 반면에, 작은 입자는 주변 공기의 표면 항력 (surface drag) 에 의해 속도가 크게 감소합니다.
이로 인해 작은 입자는 레이저 빔을 통과하는 데 더 오랜 시간이 걸리며, 분석에서 큰 입자에 비해 과대표시 (over-represented) 됩니다.
결과적으로 실제 입자 크기보다 더 미세한 분포가 나타나며, 이는 잘못된 분석 결과를 초래합니다. 이러한 현상은 속도 편향 (velocity bias) 이라고 불립니다.
이와 같은 설계상의 두 가지 오류 (샘플 밀링과 미세 입자의 느려진 이동) 는 분석 결과를 실제보다 더 미세하게 나타내게 만듭니다.
일반적으로 더 미세한 결과가 더 나은 분산으로 오인되기도 하지만, 실제로는 잘못된 설계가 사용자에게 보기에는 좋은 결과처럼 보이지만 정확하지 않은 데이터를 제공할 수 있습니다.
이를 검증하는 산성 테스트 (확인 테스트) 는 샘플을 서로 다른 압력에서 테스트하는 것입니다. 만약 동일한 결과를 제공할 수 있는 압력 범위를 찾을 수 없다면, 해당 결과는 의심스러울 수밖에 없습니다.
이 기술의 또 다른 단점은 특히 제약 활성 성분 (API) 을 다룰 때 심각한 건강 및 안전 문제를 야기할 수 있다는 점입니다.
활성 성분이 밀폐된 시스템이 아닌 공기 중에 노출될 경우 작업자의 건강과 안전에 위험을 초래할 수 있습니다.
Which type of eductor should be used?
지난 20년 동안 건식 분말 공급 장치에서 이루어진 최종 개선 사항 중 하나는 전통적인 Standard Eductor 보다 Co-axial Eductor 의 사용이 증가한 것입니다.
초기에는 Standard Eductor 가 파쇄에 민감하지 않은 입자를 분산시키는 데만 사용되었기 때문에, Eductor 내에서의 분산 과정은 매우 공격적이었습니다.
그러나 결정성 제약 분말과 같은 더 취약한 물질을 측정하려는 경우에는 Standard Eductor 를 사용할 수 없었는데, 이는 샘플이 밀링되기 때문이었습니다.
이러한 이유로, 특정 압력 범위에서 밀링 없이 분산이 가능한 덜 공격적인 Co-axial Eductor 가 도입되었습니다.
Co-axial Eductor 의 장점은 샘플 흐름 경로가 직선으로 설계되어 있어, 흐름 경로에 90 도 굴곡이 없다는 점입니다. 따라서 응집성이 강한 제약 샘플도 입자 간 전단 (particle-particle shear) 과
입자-벽 전단 (particle-wall dispersion) 만으로 분산이 가능합니다. 설계에 90도 굴곡이 없으므로 결정성 입자가 밀링되어 잘못된 작고 과소평가된 결과를 초래하는 일이 없습니다.
Bettersize 는 이러한 모든 개선 사항을 건식 분말 공급 장치 설계에 적용하였으며, 이러한 건식 시스템으로 측정된 제약 샘플 결과를 살펴봄으로써 그 타당성을 입증할 것입니다.
Methods
Micro-crystalline Cellulose, Sodium Starch Glycolate, Dextrin, Cetirizine Hydrochloride, Ticagrelor, Omeprazole, Flunarizine Hydrochloride, Magnesium Stearate, Amlodipine Besylate 의
입자 크기 분포를 측정하기 위해 선택된 레이저 회절 시스템은 Bettersizer 2600 입니다.
이 시스템은 광학 벤치, 최근 20년 동안 이루어진 모든 개선 사항 (공급 제어, 일정한 직경의 튜브를 포함한 샘플 흐름 경로, Co-axial eductor 사용, 밀폐된 셀) 을 준수하도록 설계된
내장형 건식 분산 시스템, 컴퓨터 및 프린터로 구성되어 있습니다.
이 시스템은 레이저 회절(laser diffraction)이라는 기본 원리 기반 기술을 사용하며, 이 기술은 48년 동안 사용되어 왔습니다.
회절 기술이 초기에 널리 사용된 이유는 빠른 결과 도출, 사용자 간 반복성, 그리고 매우 넓은 입자 크기 범위에 대한 해상도 때문입니다.
How does laser diffraction work?
원래의 레이저 회절 시스템은 프라운호퍼 (Fraunhofer) 이론을 사용했습니다. 이 이론은 모든 입자가 불투명하고 구형이라고 가정합니다.
또한 입자와 레이저 빛의 상호작용이 있을 때 모든 산란광이 회절광이라고 가정하며, 입자로부터 굴절되거나 반사된 빛은 고려하지 않습니다.
반면, 미(Mie) 이론은 대부분의 입자에 적합한 산란광 필드를 설명하는 엄밀한 이론입니다.
하지만 입자 크기가 레이저 파장의 40배 (보통 25마이크론 이상) 보다 클 경우, 미 산란 계산의 필요성이 줄어들고 프라운호퍼 이론을 대신 사용할 수 있습니다.
레이저 빔이 입자 흐름과 상호작용하면 입자들은 조사되며, 일부 빛은 원래의 전파 방향에서 산란됩니다. 이를 레이저 빛 산란 또는 레이저 회절이라고 합니다.
입자의 크기는 빛의 강도와 산란 각도 모두에 영향을 미칩니다. 광학 시스템은 반도체 레이저에서 나오는 레이저 빔으로 구성되며, 이 빔은 웨이브 필터를 통과하면서 확장되고
평행 빔으로 정렬됩니다.
샘플 측정 셀은 레이저 빔 경로에 설치되며, 전방 포토디텍터는 집광 렌즈의 초점 평면에 설치되어 큰 입자가 생성하는 전방 산란광을 감지합니다.
반면, 측면 및 후방 포토디텍터는 작은 입자와 서브미크론 입자가 생성하는 산란 신호를 수집합니다.
입자 크기가 작을수록 넓은 산란 각도에서 낮은 수준의 레이저 빛을 회절시키는 반면, 입자 크기가 클수록 좁고 작은 각도의 산란 범위를 커버하며 더 높은 강도의 산란광을 생성합니다.
이 빛 신호는 전기 신호로 변환되며, 이는 미 이론을 기반으로 한 역산 계산에 사용되어 입자 크기 분포를 제공합니다.
미 이론은 입자 크기, 농도, 회절 각도 및 산란광 강도 간의 정량적 관계를 설명합니다. 이 관계를 기반으로 레이저 회절 입자 크기 분석기를 사용하여 입자 크기 분포를 측정할 수 있습니다.
Bettersize 의 레이저 회절 시스템은 신뢰성, 정확성 및 가성비 면에서 잘 알려져 있습니다. 그러나 이 회사의 세계적인 건식 분말 피더(dry powder feeder)의 성능은 상대적으로 덜 알려져 있습니다.
Bettersize 의 건식 분말 피더는 제약 제품과 같은 응집성 물질을 분쇄하지 않고 분산시키는 능력에서 다른 시스템을 능가합니다.
시멘트와 같이 높은 분산 압력에서도 파손되거나 마모되지 않는 재료가 있는가 하면, 다른 재료는 0 bar 이상의 압력에서 2 bar 까지는 탈응집 (deagglomeration) 이 가능하며,
이후 3 bar 이상의 압력에서는 입자 크기 분포를 유지합니다. 표준 작업 절차 (SOP) 의 일환으로, 작업 압력은 이 작업 영역 (2bar ~ 3bar) 중간 지점인 2.5 bar 로 설정해야 합니다.
우리는 압력이 증가함에 따라 Standard Eductor 에 의해 분쇄되지만, Co-axial Eductor 를 사용할 경우 분쇄되지 않는 결정질 재료 (예: 제약 제품) 의 사례를 가지고 있습니다.
일부 제약 성분에서는 1bar 에서 4bar 의 압력에서 측정을 수행하더라도 결과에 큰 변화가 없습니다.
이를 통해 제약 제품과 같은 많은 취약하거나 결정질 재료를 특수 용매 없이 건식 방식으로 성공적으로 분석할 수 있으며, 결과에 대해 완벽한 신뢰를 가질 수 있음을 추론할 수 있습니다.
따라서 제약 성분을 분석할 때 사용하는 방법은 샘플의 최소 99% 를 공급하고 분석할 수 있는 건식 분말 공급 시스템을 사용하는 것입니다.
또한 기술자는 Co-axial Eductor 와 완전히 밀폐된 샘플 셀을 포함하는 건식 분말 공급기를 사용하여 속도 편향 (velocity biasing) 이 발생하지 않도록 해야 합니다.
추가적으로, 가장 적합한 작업 압력 범위를 결정하기 위해 전체 압력 적정 (pressure titration) 을 수행해야 합니다. 샘플 흐름 경로에서 분말이 분쇄되는 일이 전혀 없어야 하며,
샘플의 탈응집 (deagglomeration) 및 분산 (dispersion) 만 이루어져야 합니다. 이를 보장하기 위해 일반적으로 0.5bar 또는 1bar 단위로 0.5/1 bar 에서 4bar 까지 압력 적정을 수행하여
전체적인 상황을 파악하고 가장 적합한 작업 조건을 평가해야 합니다.
측정된 각 샘플 유형은 고유한 압력 적정 곡선을 생성합니다. 테스트된 샘플은 고유한 적정 지문 (titration fingerprint) 을 나타내며, 테스트된 샘플에는 활성 제약 성분 (API) 과
비활성 재료 (바인더 등) 가 포함됩니다. 테스트된 재료로는 Microcrystalline Cellulose, Sodium Starch Glycolate, Dextrin,
Cetirizine Hydrochloride, Ticagrelor, Omeprazole, Flunarizine Hydrochloride, Magnesium Stearate, Amlodipine Besylate 가 있습니다.
일부는 쉽게 분산되지만, 처음에는 고도로 응집된 상태로 제공되는 샘플도 있습니다. 이러한 더 정체되고 응집된 샘플의 경우, 간단한 선분산 (pre-dispersion) 방법으로는
샘플 공급 트레이를 체망 팬 (sieve pan) 에 놓고, 500 또는 625 마이크론 체를 체망 팬과 공급 트레이 위에 놓은 다음, 체 위에 샘플을 올려놓고 작은 금속 물체로 체 가장자리를 두드려
순간적인 진동을 생성하는 것이 있습니다.
30초 이내에 모든 샘플이 체를 통과하며, 덩어리 형태에서 훨씬 더 미세한 분말로 탈응집되며, 이 과정에서 샘플이 파손되지 않습니다. 이는 간단하지만 효과적인 선분산 방법입니다.
더 큰 자유 흐름 분말 (free flowing powder) 의 경우, 이 작업은 필요하지 않습니다. 샘플 트레이의 진동률은 샘플이 동축 이덕터를 통해 샘플 셀로 제어된 방식으로 공급되도록
설정해야 합니다. 너무 많지도, 너무 적지도 않아야 합니다. 불투명도 (obscuration) 모니터가 사용자에게 적절한 진동 수준을 결정하는 데 도움을 줍니다.
샘플은 이렇게 설정된 방식으로 최소한 4개의 압력 (0.5~4bar) 에서 각각 3회 측정합니다.
Results
첫 번째로 테스트한 샘플은 미세결정 셀룰로오스(MCC) 로, 이는 제약 산업에서 활성 제약 성분(API) 을 결합하는 데 일반적으로 사용되는 부형제입니다.
MCC 는 우수한 압축 성질을 가지고 있어 정제와 같은 고형 제제에 사용됩니다.
정제는 단단하지만 빠르게 용해될 수 있어야 하며, 이는 활성 제약 성분이 체내에 쉽게 흡수될 수 있도록 하는 데 필수적입니다.
MCC 는 제약 산업에서 가장 일반적으로 사용되는 셀룰로오스 유래 부형제입니다.
MCC는 자유롭게 흐르는 물질이기 때문에 결합력을 높이기 위해 정제 제형에 Binder 를 추가해야 하며, 이를 통해 분말에 필요한 결합력이 제공됩니다.
MCC는 샘플 분석을 위해 샘플 공급 트레이에 직접 추가할 수 있습니다. Figure 1 에서 볼 수 있듯이, 4가지 압력에서의 결과는 매우 유사합니다.
따라서 이 샘플을 분석하기 위한 특정 작업 범위를 찾기 위해 더 세부적인 내용을 살펴봐야 하므로, 우리는 핵심 매개변수를 엑셀로 내보내어 압력 적정 곡선을 생성했습니다.
Figure 2에서 즉시 볼 수 있듯이, D10, D50, D90 값은 1 과 2 Bar 에서는 평평하지만, 2 와 4 Bar 사이에서는 크기가 약간 줄어듭니다.
샘플이 크지만 결정질이기 때문에 2 Bar 이상의 압력에서 D10과 D50 값에서 결정질 물질의 일부 파괴가 발생했을 가능성이 있습니다.
이 정보를 바탕으로, 이 물질을 측정하기 위한 작업 압력 범위는 1과 2 Bar 사이로 추정할 수 있습니다.
제 개인적인 선호는 MCC 를 1 Bar 압력에서 측정하는 것입니다. 이때 D10 은 15.77μm, D50 은 55μm, D90 은 125.4μm 입니다.
Figure 1. MCC particle size distribution from different pressures
Figure 2. Values for the d10, d50 and d90 of MCC from different pressures
Figure 3. Sodium starch glycolate particle size distribution from different pressures
Figure 4. Values for the d10, d50 and d90 of Sodium starch glycolate from different pressures
다음으로 테스트한 샘플은 Sodium Starch Glycolate 로, 이는 제약 등급의 용해 보조제로 정제와 캡슐에 사용됩니다. Sodium Starch Glycolate 는 물을 빠르게 흡수하여 팽창하고,
이로 인해 정제와 과립이 빠르게 분해됩니다. 이 물질은 분해제, 유화제 및 겔화제로 사용됩니다.
분해제가 없으면 정제가 적절하게 용해되지 않을 수 있으며, 이로 인해 활성 성분의 흡수량이 영향을 받아 효과가 감소할 수 있습니다.
이 샘플은 Figure 3 과 같이 1-4 Bar 범위에서 4가지 압력으로 측정되었습니다. 또 다른 자유 흐름 물질이었기 때문에 사전 분산 처리는 필요하지 않았습니다.
4가지 압력에서의 결과는 완벽한 비교 Plot 를 생성했습니다. 이 시각적 정보를 통해 자연적인 응집체가 없고, 2마이크론보다 작은 미세 입자의 비율이 매우 적다는 것을 추정할 수 있습니다.
더 구체적인 정보를 찾기 위해 D10, D50, D90 값을 엑셀 스프레드시트로 내보냈으며, 이는 그림 4에 나와 있습니다. 나트륨 전분 글리콜레이트는 MCC보다 더 미세한 제품이므로,
1g 의 물질당 측정해야 할 입자 수가 많아지며, 따라서 샘플의 양이 적어도 반복성에 영향을 주지 않고 공급 속도를 낮출 수 있습니다.
결과에서 볼 수 있듯이, D10, D50, D90 값은 2 - 4 Bar 압력 범위에서 완전히 일관됩니다. 유일한 미세한 차이는 1 Bar 압력에서의 D90 값으로, 그 크기는 60.07 마이크론으로
2 - 4 Bar 압력에서의 D90 값보다 1.5% 더 높았습니다. 따라서 완벽한 결과를 얻으려면 이 물질의 모든 측정은 2 - 4 Bar 압력 범위에서 이루어져야 합니다.
제 개인적인 선호는 3 Bar 압력에서 MCC를 측정하는 것입니다. 이때 D10 은 19.04 마이크론, D50 은 35.44 마이크론, D90 은 59.16 마이크론입니다.
Figure 5. Dextrin particle size distribution from different pressures
Figure 6. Values for the d10, d50 and d90 of Dextrin from different pressures
Dextrin 은 제약에서 증점제 및 결합제로 사용되며, 전분이나 글리코겐의 가수분해에 의해 생성되는 저분자량 탄수화물의 그룹입니다.
이들은 alpha-(1->4) 또는 alpha-(1->6) glycosidic bonds 로 연결된 D-포도당 단위들의 고분자 혼합물입니다.
덱스트린은 암/종양 치료와 고형 종양 연구에 사용됩니다.
Figure 5에 표시된 것처럼 덱스트린은 1 - 4 Bar 사이의 압력에서 사전 분산 처리 없이 측정되었습니다. 덱스트린은 나트륨 전분 글리콜레이트보다 더 미세하므로,
같은 시험 시간 내에 1 gram 당 측정해야 할 입자가 훨씬 많아지며, 그에 따라 공급 속도를 더 낮출 수 있어도 반복성에는 영향을 미치지 않습니다.
비교 그래프에서 볼 수 있듯이, 처음에 Figure 5 에서 덱스트린 입자 크기 분포가 다양한 압력에서 잘 겹쳐 보입니다.
하지만 자세히 살펴보면 20 - 50 마이크론 구간에서 겹침이 완벽하지 않음을 알 수 있습니다.
이 시점에서 D10, D50, D90 값을 엑셀 스프레드시트로 내보내서 최적의 압력 범위가 어디인지 평가할 필요가 있습니다. D90 의 경우, 값이 23.41 마이크론에서 3 Bar 에서 21.65 마이크론으로
일정하게 감소하는 것을 확인할 수 있습니다(Figure 6 참조). 4 Bar 에서의 결과는 3 Bar 에서의 결과와 동일하여, 1 - 3 Bar 사이에서 샘플의 약간의 탈응집 (deagglomeration) 이 일어났고,
3 - 4 Bar 사이에서 결과가 안정적으로 유지되었음을 의미합니다.
D50 과 D10 값에 대해서도 같은 결론을 내릴 수 있습니다. 따라서 덱스트린의 최적 작업 압력 범위는 3 - 4 Bar 사이임을 안전하게 결론지을 수 있습니다.
저는 3 Bar 에서 측정을 선택하며, 이 덱스트린 샘플의 결과는 D10 에서 7.08 마이크론, D50 에서 13.83 마이크론, D90 에서 21.65 마이크론입니다.
Figure 7. Cetirizine Hydrochloride particle size distribution from different pressures
Figure 8. Values for the d10, d50 and d90 of Cetirizine Hydrochloride from different pressures
Cetirizine Hydrochloride 은 알레르기 증상 (눈물, 콧물, 눈/코 가려움증, 재채기, 두드러기, 가려움증 등) 을 완화하는 데 사용되는 항히스타민제입니다.
이 샘플은 1.5 에서 4 Bar 사이의 6가지 다른 압력에서 측정되었습니다 (Figure 7 참조).
이전에 측정된 샘플들보다 입자 크기 범위가 훨씬 미세하므로, 앞서 설명한 체망과 탭 체망 방법을 사용하여 사전 분산을 권장합니다.
이번 테스트에서는 이 사전 분산 방법을 사용하지 않았지만, 위의 비교 데이터에서 볼 수 있듯이, 응집체는 1.5 에서 2 Bar 사이의 압력에서만 보입니다.
중요한 점은 1.5 Bar 와 2 Bar 분석에 대한 빨간색과 녹색 분포 곡선을 제외하면 입자 크기 범위가 0.2 마이크론에서 30 마이크론 사이에 있다는 것입니다.
2.5 Bar 이상의 압력에서는 눈에 띄는 응집체가 없었지만, 정확히 어떤 압력 또는 압력 범위에서 작업해야 할지를 확인하기 위해 데이터를 엑셀로 내보내어 숫자를
살펴볼 필요가 있습니다 (Figure 8 참조).
엑셀로 내보낸 D90 값을 보면, 2.5 Bar 압력에 도달했을 때 모든 응집체가 분산되었음을 확인할 수 있습니다. 2.5 Bar 이상의 증가된 압력에서는 D10, D50, D90 값들이 꾸준히
약간 감소하는 것을 볼 수 있습니다. 따라서 이 샘플을 측정할 때는 2.5 Bar에서 측정하고, 앞서 설명한 체망과 체망 팬 방법을 사용하여 샘플을 사전 분산하는 것이 가장 현명할 것입니다.
Figure 9. Ticagrelor particle size distribution from different pressures
Figure 10. Values for the d10, d50 and d90 of Ticagrelor from different pressures
Ticagrelor 는 항혈소판제입니다. 이 약물은 혈액이 혈관을 쉽게 통과하도록 하여 혈액이 위험한 혈전 (혈액 응고) 을 형성할 가능성을 줄여줍니다.
Ticagrelor 를 복용하면 혈전이 생길 위험이 있는 경우 혈전을 예방하는 데 도움이 될 수 있습니다.
이 샘플은 미세하고 매우 정전기적이므로, 체망과 체망 팬 방법을 사용하여 샘플을 사전 분산해야 합니다.
Figure 9 에서 비교 그래프를 보면, 낮은 분산 압력에서 35 마이크론 이상의 응집체가 존재하는 것이 보이며, 이를 높은 압력의 분산 공기로 분산시켜야 합니다.
작업 압력 범위를 찾는 가장 좋은 방법은 Figure 10 에서 내보낸 데이터를 확인하는 것입니다. 1 - 4 Bar에서 D90 값을 살펴보면,
샘플은 1 - 2.5 Bar 에서 탈응집되며 전형적인 S 자 곡선을 나타냅니다. 3 Bar 이상의 압력에서는 결정질 물질의 일부 파손이 보입니다.
변화가 없는 전환점 (2.5 - 3 Bar) 에서 결과에 변화가 없으므로, 이 구간이 우리의 작업 압력 범위가 되며,
최적의 작업 압력은 3 Bar로 선택하며, 이때 D10 은 1.765, D50 은 4.782, D90 은 11.33 마이크론입니다.
Figure 11. Omeprazole particle size distribution from different pressures
Figure 12. Values for the d10, d50 and d90 of Omeprazole from different pressures
처방약 오메프라졸 (Omeprazole) 은 위식도 역류질환 (GERD) 의 증상을 치료하는 데 사용됩니다. 이 질환은 위에서 발생한 산이 식도를 거꾸로 역류시켜 가슴 통증과
식도 손상을 일으킬 수 있는 상태로, 성인과 1세 이상의 어린이에게 발생할 수 있습니다. 이 샘플은 1 - 4 Bar 범위의 4개 압력에서 측정하였습니다.
Figure 11 의 비교 그래프에서 보듯이, 이 샘플은 주로 20 마이크론 이하 크기의 다른 API 보다 훨씬 더 쉽게 분산됩니다. Figure 12 에 표시된 적정 곡선을 확인해 보겠습니다.
1 - 2 Bar 사이에서 탈응집이 일어나고, 3 - 4 Bar 사이에서는 파손이 발생합니다. 그러나 S-커브 모양의 D90 을 보면 2 - 3 Bar 사이에 확실한 변곡점이 있으며
결과에서 변화가 최소화됩니다. 이는 우리가 반복 가능한 측정을 자신 있게 수행할 수 있는 압력 범위입니다.
저는 2 Bar 압력을 추천하며, 이때 D10 은 0.771, D50 은 2.65, D90 은 7.237 마이크론입니다.
Figure 13. Flunarizine Hydrochloride particle size distribution from different pressures
Figure 14. Values for the d10, d50 and d90 of Flunarizine Hydrochloride from different pressures
플루나리진 염산염 (Flunarizine Hydrochloride) 은 칼슘 유입 차단제로, 칼모듈린 결합 특성과 히스타민 H1 차단 활성을 가지고 있습니다.
이 약물은 편두통 예방, 폐쇄성 말초 혈관 질환, 중심 및 말초 원인에 의한 어지러움, 그리고 간질 치료의 보조제로 효과적입니다.
Figure 13 의 비교 그래프에서 볼 수 있듯이, 가장 작은 크기는 변하지 않지만 최대 크기는 0.5 에서 4 Bar 의 압력 범위에서 급격하게 이동합니다.
이 샘플을 추가로 분석하기 위해서는 Figure 14 에 있는 압력 적정 곡선을 확인해야 합니다.
Figure 에서 알 수 있듯이, 이 적정 곡선에서 D10 과 D50 백분위수만을 보면 두 개의 변곡점이 존재하며, 이는 각각 2 - 2.5 Bar 와 3 - 3.5 Bar 범위에 해당합니다.
2 - 2.5 Bar 범위와 3 - 3.5 Bar 범위에서 D10 과 D50 결과를 살펴보면 좋은 반복성이 있습니다.
유사한 결과를 위해 첫 번째 변곡점을 항상 찾아야 하므로, 2 Bar 에서 분산 압력을 선택하는 것이 좋습니다.
Figure 15. Magnesium stearate particle size distribution from different pressures
Figure 16. Values for the d10, d50 and d90 of Magnesium stearate from different pressures
마그네슘 스테아레이트 (Magnesium stearate) 는 두 가지 지방산 (주로 스테아르산과 팔미트산) 과 하전된 마그네슘을 포함하는 가장 많이 사용되는 금속염 경계 윤활제입니다.
마그네슘 스테아레이트는 주로 약물 캡슐에 사용되는 첨가제로, 그 주요 역할은 캡슐 내 개별 성분이 서로 달라붙거나 캡슐을 만드는 기계에 붙는 것을 방지하는 것입니다.
이는 약물 캡슐의 일관성 및 품질 관리를 개선하는 데 도움을 줍니다. 마그네슘 스테아레이트 없이도 약물 캡슐을 만들 수 있지만, 캡슐의 일관성과 품질을 보장하기가 더 어려워집니다.
마그네슘 스테아레이트는 약물이 올바른 장의 부위에서 흡수되도록 지연시키는 역할도 합니다.
Figure 16 에서의 분석에 따르면, 최대 크기의 입자는 167 마이크론이고, 최소 입자는 압력에 따라 0.3 - 0.4 마이크론 사이입니다.
Figure 16 에 표시된 적정 곡선을 자세히 살펴보면, 매우 끈적이는 이 물질이 높은 압력에서만 완전히 분산된다는 것을 알 수 있습니다.
실제로 3.5 Bar 압력에 도달할 때까지 변곡점이 없습니다. 따라서 완전한 분산은 4 Bar 압력에 도달할 때까지 이루어지지 않는다고 말할 수 있습니다.
Figure 17. Amlodipine Besylate particle size distribution from different pressures
Figure 18. Values for the d10, d50 and d90 of Amlodipine Besylate from different pressures
암로디핀 베실레이트(Amlodipine Besylate) 는 고혈압을 치료하는 데 사용되는 약물입니다. 고혈압이 있는 경우 암로디핀을 복용하면 향후 심장 질환, 심장마비 및 뇌졸중을 예방하는 데 도움이 됩니다.
암로디핀은 또한 심장 질환으로 인한 흉통(협심증)을 예방하는 데 사용됩니다.
Figure 17 의 비교 플롯에서 우리는 최대 입자 크기가 약 150 에서 200 마이크론 사이이고, 모든 압력에서 최소 입자 크기는 0.3 마이크론임을 알 수 있습니다.
Figure 18 에 있는 적정 곡선을 살펴보면, 변곡점에 가까운 유일한 압력 범위는 0.1 과 1 Bar 사이에 있는 것을 볼 수 있습니다.
1 Bar 이상의 압력에서는 결정 물질이 깨지는 것처럼 보입니다. 0.5 Bar 이하의 압력에서 측정이 이루어지면 0.2 와 0.5 Bar 사이에서 작업 압력 범위를 확인할 수 있을 것입니다.
0.2 Bar에서 측정이 이루어지지 않았기 때문에 우리가 알고 있는 것에 대해서만 추천할 수 있으며, 가장 근접한 결과는 0.5 Bar에서 얻은 D10 은 6.646, D50 은 21.86, D90 은 61.46 마이크론으로 보입니다.
Discussion
결과에 대한 검토에서 일부 샘플은 모든 압력 설정에서 잘 분산되었다고 판단할 수 있을 만큼 충분한 반복성을 보였으나, 다른 샘플들은 그만큼 명확하지 않아 압력 적정 곡선을 작성하기 위해
엑셀로 내보낸 데이터를 다시 검토할 필요가 있었습니다.
이를 통해 D10, D50 및 d90 파라미터를 다른 방식으로 살펴보아 더 나은 분산을 제공한 압력과 입자 파괴가 일어난 압력을 파악할 수 있었습니다.
이 적정 곡선을 분석한 결과, 9개의 서로 다른 제약 샘플은 5개의 그룹으로 나눌 수 있었습니다.
첫 번째 그룹은 MCC 와 Sodium Starch Glycolate 로 구성되며, 적정 곡선을 보면 비슷한 방식으로 성능을 발휘했습니다. 결과적으로 Sodium Starch Glycolate 는 모든 압력에서 거의 동일한
입자 크기 분포를 보였습니다. 그러나 MCC 는 1 - 2 Bar 사이에서 반복 가능한 결과를 얻을 수 있었으며, 따라서 이 범위 내에서 샘플의 완전한 분산이 이미 이루어진 것으로 볼 수 있습니다.
반면 3 Bar 와 4 Bar 에서 D90 은 동일했지만 D50 의 크기는 8%, D10 은 20% 감소한 것으로 보아 분쇄가 일어난 것으로 추정됩니다.
따라서 MCC의 압력 측정 범위는 1 - 2 Bar로 설정하는 것이 안전합니다.
두 번째 그룹은 Dextrin 만 포함되어 있으며, 비교 결과는 매우 좋았지만 적정 곡선을 통해 완벽한 압력 범위를 찾을 수 있었습니다.
표면적으로는 다른 전형적인 적정 곡선 모양을 보이며 샘플이 잘 분산된 것처럼 보였지만, D10, D50 및 D90 의 절대적인 반복성을 확인해야만 3 Bar 에서 완전한 분산이 이루어졌고,
4 Bar에서 같은 결과가 나왔다는 것을 알 수 있었습니다. 따라서 3 - 4 Bar 범위 내에서 압력을 설정하면 정확한 결과를 신뢰할 수 있습니다.
세 번째 그룹은 Omeprazole 과 Cetirizine Hydrochloride 로 구성되며, 두 샘플 모두 동일한 초기 분산 단계를 가지고 있습니다.
Cetirizine Hydrochloride 의 경우, 비교 그래프에서 1.5 와 2 Bar 에서 명확한 응집이 나타나지만 2.5 Bar 에서는 그렇지 않음을 알 수 있습니다.
압력 적정 곡선을 살펴보면 2.5 -4 Bar 에서 D10, D50 및 D90 값이 서서히 감소하는 것을 확인할 수 있습니다.
이를 통해 2.5 Bar가 가장 적합한 압력임을 알 수 있습니다.
Omeprazole 은 다소 다르게 2 Bar 에서 완전한 분산이 이루어졌고, 그 이후에는 입자 분쇄가 발생한 것으로 보입니다.
네 번째 그룹은 Ticagrelor 와 Flunarizine Hydrochloride 로, 비교 그래프만 보면 혼란스러워 보입니다. 따라서 최적의 압력 또는 압력 범위를 찾기 위해서는
적정 곡선을 살펴봐야 합니다. Ticagrelor 샘플은 전형적인 S자형 적정 곡선을 보이며, 1 - 2.5 Bar 에서 응집이 풀리고 2.5 Bar 에서 3 Bar 까지 곡선에 변화가 있음을 알 수 있습니다.
2 - 3 Bar 에서 반복 가능한 결과가 얻어졌으며, 이 이상의 압력에서는 모든 파라미터에서 분쇄가 일어났습니다. 따라서 2 - 3 Bar 범위가 작업 압력 범위입니다.
Flunarizine Hydrochloride 의 경우, 0 - 2 Bar 에서 응집이 풀리고, 2 - 2.5 Bar 에서 D10 과 D50 은 안정적인 반복성을 보이지만 D90 에서는 약간의 크기 감소가 나타났습니다.
2.5 Bar 이상의 압력에서는 입자 분쇄가 일어났습니다.
D10 과 D50 은 2 와 2.5 Bar 에서 비슷하며, d9 0의 분쇄가 2 Bar 이상에서 발생하는 것으로 보아, 이 샘플의 분산 압력은 2 Bar 로 설정하는 것이 적절할 것입니다.
다섯 번째 그룹은 Magnesium stearate 와 Amlodipine Besylate 로 구성되며, 두 샘플 모두 0.5 Bar 에서 4 Bar 까지 D10, D50, D90 이 점진적으로 감소하는 경향을 보입니다.
비교 그래프에서는 힌트가 없고, 적정 곡선에서도 변곡점이 나타나지 않습니다. 이러한 샘플에 대해서는 올바른 압력을 찾기 위해 추가적인 정보를 찾아야 합니다.
먼저 할 수 있는 것은 0.1 Bar 에서 0.5 Bar 까지의 압력에서 샘플이 이미 분산되었는지를 확인하는 것입니다. 또 다른 가능성은 디지털 이미지 분석을 통해 입자들이
다양한 압력에서 어떻게 변화하는지를 살펴보는 것입니다. 마지막으로, 정확한 성공적인 습식 분석을 찾아 가장 근접한 건식 분석 압력과 비교하는 방법도 있습니다.
Conclusions
오늘날 제약 산업에서 수행되는 대부분의 시간 소모적인 습식 분석 테스트는 제가 이미 설명한 지침을 사용하여 건식 측정으로 쉽게 대체될 수 있습니다.
모든 압력에서 압력 적정 곡선을 이용한 초기 철저한 건식 테스트는 대부분의 경우 적절한 작업 압력 또는 압력 범위를 도출해낼 수 있습니다.
건식 분말 레이저 회절 입도 분석은 제약 산업에서 요구하는 속도, 재현성 및 사용 용이성을 제공합니다. 일부 샘플에 대해서는 향후 추가적인 작업이 지속적으로 이루어져야 하며,
이는 디지털 이미지 분석, 낮은 압력 범위 및 습식 분석 결과와의 비교를 포함해야 합니다.
|
|
|
|
