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Introduction
Molecular Weight of Sucrose (left : 342.3Da) & Glucose (right : 180.16Da)
동적 광산란(DLS) 기술에 의해 얼마나 미세한 입자를 검출할 수 있는가? 하는 것은 입도분석기의 Optical Path Design, 레이저 출력, 검출기 유형, Computational Correlator 의 계산 능력 등
다양한 요인에 의해 영향을 받으며 이는 사용자들에게 주요 관심사가 되어 왔습니다.
이전에 진행된 연구들을 살펴 보면 분자량이 작은 샘플 (예: sucrose (분자량: 342.3 Da) 와 비타민 B1 (분자량: 337.29 Da)) 의 입도를 측정하는데 성공하여 DLS 가 검출할 수 있는 한계를 검증하였습니다.
분자량이 300-400 Da 범위에 속하는 이 작은 분자들은 매우 낮은 분자량, 약한 산란 신호, 빠른 상관 함수의 감소로 인해 DLS 장비가 측정하기에 매우 어려운 과제였습니다.
이 애플리케이션 노트에서는 Bettersize사의 BeNano 나노 입자 분석기를 사용하여 비타민 B1보다 더 낮은 분자량을 가진 Glucose 의 측정을 시도하였습니다.
Glucose 는 분자량이 180.16 Da 에 불과해 Sucrose 보다 분자 크기가 작고, Scattering Ability 도 Sucrose 에 비해 낮아 측정이 더욱 까다로왔습니다.
Instrumentation
이 실험에서는 Bettersize Instruments 사의 BeNano 180 Nanoparticle Size Analyzer 를 사용하였습니다.
이 장비는 671 nm 파장의 레이저 소스와 50 mW 출력의 레이저를 탑재하고 있습니다.
산란된 광 신호는 173도 각도로 배치된 APD 검출기를 통해 수집됩니다.
signal-to-noise ratio 를 최적화하기 위해 Single-mode Optical Fibers 를 신호 전송에 사용하였습니다.
BeNano 분석기는 Nanosecond 수준에서 작동하는 High-speed Correlator 를 갖추고 있어 작은 입자와 관련된 Correlation Functions 의 Rapid Decay 에 대해 신속한 Correlation Calculations 이 가능합니다.
Viscosity correction
Sucrose 와 Glucose 의 수용액 점도가 농도에 따라 변동하기 때문에 측정 전에 점도 정보를 보정했습니다.
이를 위해 지름이 100 nm 인 Polystyrene Spheres 를 용액에 첨가했습니다. 폴리스티렌 구체의 확산 계수(D) 를 측정하여 점도 정보를 얻었으며,
이는 점도(η), 확산 계수(D), 입자 지름(dH) 간의 관계를 나타내는 Stokes-Einstein 방정식을 사용하여 계산되었습니다.
이러한 방법은 DLS 에서 미지 용액의 점도를 결정하는 데 흔히 사용되며, 특히 시료의 양이 제한되어 Rheometer 나 점도계의 요구 조건을 충족할 수 없는 경우에 유용합니다.
Sucrose 와 Glucose 분자는 크기가 작고 산란이 매우 약하기 때문에 100 nm 폴리스티렌 구체에 비해 신호에 대한 기여도가 무시할 수 있을 정도로 적습니다.
측정된 점도 값은 표 1과 표 2에 제시되어 있습니다.
Table 1. Glucose Samples
Table 2. Sucrose Smaples
Experiment
Glucose 와 Sucrose 의 농도를 10% 와 20% 로 맞춘 용액을 준비했습니다.
BeNano의 내장된 온도 제어 시스템은 실험 온도를 25°C ± 0.1°C 로 유지했습니다.
샘플 입자가 매우 작고 산란이 약하다는 점을 고려할 때, 먼지와 같은 불순물의 존재는 검출 과정에 큰 영향을 미칠 수 있습니다.
이를 해결하기 위해 실험 중에 220 nm PTFE 필터를 사용하여 샘플을 필터링했습니다.
필터링된 샘플은 큐벳에 직접 주입되었으며, 각 샘플은 결과의 재현성을 평가하고 표준 편차를 얻기 위해 최소 세 번 측정되었습니다.
Results and Discussion
Raw Scattered Light Signals 을 기반으로 correlation functions 와 size distribution 결과를 얻었습니다.
Figure 1. Correlation Functions of Glucose Solution at a Concentration of 20%
Figure 2. Intensity Distribution of Glucose at a Concentration of 20%
Figure 3. Correlation functions of glucose solution at a concentration of 10%
Figure 4. Intensity distributions of glucose solution at a concentration of 10%
Figure 5. Correlation functions of sucrose solution at a concentration of 20%
Figure 6. Intensity distributions of sucrose solution at a concentration of 20%
Figure 7. Correlation functions of sucrose solution at a concentration of 10%
Figure 8. Intensity distributions of sucrose solution at a concentration of 10%
상관 함수는 작은 입자에서 빠른 감쇠를 보여주며, 이는 큰 입자에 비해 더 빠른 브라운 운동을 나타냅니다.
이러한 상관 함수는 양호한 신호 대 잡음비를 보이며 높은 재현성을 보여줍니다.
상관기가 매우 짧은 시간의 상관 계산을 수행할 수 있는 능력을 갖추고 있어 상관 함수에서 충분한 신호 포인트를 확보하여 작은 입자의 정확한 측정을 가능하게 합니다.
Table 3. Particle size results for sucrose and glucose
그림 1, 3, 5 및 7은 다양한 농도에서 수행된 여러 테스트의 상관 함수를 보여줍니다.
이 결과는 Sucrose 와 Glucose 용액의 상관 함수가 우수한 재현성을 가지며 두 가지 뚜렷한 감쇠를 나타내는 것을 보여줍니다.
이는 이러한 용액에 입자 크기가 상당히 다른 두 개 이상의 분획이 존재함을 의미합니다.
이전 연구에서는 Sucrose 용액에서 큰 분자 집합체가 존재함을 밝혔으며, 이는 그림 6 과 그림 8 에 나타난 입자 크기 분포 곡선과 일치합니다.
Figure 9. Normalized correlation functions for sucrose and glucose at a concentration of 10%
Figure 10 은 10% Sucrose 와 10% Glucose 샘플의 normalized 된 correlation functions 를 보여줍니다.
Glucose 샘플의 상관 함수의 첫 번째 감쇠가 더 빠른 속도로 감쇠하는 것이 명확히 나타납니다.
이러한 현상은 확산 속도가 더 높은 더 작은 Glucose 분자에서 볼 수 있는 현상입니다.
Figure 10. Overlay of intensity distributions of glucose and sucrose solution at a concentration of 10%
Figure 10 에 나타난 10% Sucrose 와 10% Glucose 의 크기 분포를 비교하면, 두 샘플 모두 약 1nm 부근에서 하나의 피크가 나타나는 것을 확인할 수 있습니다.
이 피크는 monosaccharide 에 해당하는 피크입니다. 또한 약 100nm 부근에서 응집체 피크가 관찰되는데, 이는 polysaccharide 에 해당하는 피크입니다.
Figure 11. Overlay of volume distributions of glucose and sucrose solution at a concentration of 10%
Figure 11 은 Volume Distribution Curve 를 보여주는 것인데, 이 그래프는 용액 내 두 샘플의 대부분이 매우 작은 단당류로 구성되어 있고, 다당류의 수준은 미미하다는 것을 의미하고 있습니다.
Figure 12. Magnified correlation functions for sucrose and glucose at a concentration of 10%
단당류 크기의 차이를 보다 자세히 분석하기 위해, 약 1nm 부근의 단당류 피크를 확대하고 좌표를 선형 좌표로 변경한 것이 Figure 12 에 나타나 있습니다.
포도당 용액의 단당류 피크가 Sucrose 용액의 피크보다 더 좁은 크기 범위를 가지는 것이 명확히 보입니다.
이러한 차이는 포도당 분자가 상대적으로 더 작은 크기를 가지고 있기 때문입니다.
Conclusions
이 application note 는 단당류 분자, 특히 Glucose 의 크기와 크기 분포 특성을 분석하는 방법을 보여줍니다.
분자량이 180 Da인 포도당을 측정하기 위해 High-speed Correlator 를 갖춘 BeNano를 사용했습니다.
점도 보정을 위해 Polystyrene Spheres 를 사용했으며, 다양한 농도에서 측정을 진행하였습니다.
결과는 Sucrose 와 Glucose 샘플의 뚜렷한 Correlation Functions 와 크기 분포를 보여주며, 단당류와 다당류가 존재하고 있다는 것을 나타내고 있습니다.
BeNano 시스템은 Glucose 와 같은 작은 입자의 검출 능력이 탁월하다는 것을 보여 주었습니다.
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