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Introduction
전통적인 나노입자 분석기는 동적 광산란 (DLS, Dynamic Light Scattering) 기술을 사용하여 샘플을 레이저 빔으로 조사하고, 액체에 분산된 입자의 브라운 운동에 의해 발생하는
산란광의 변동을 감지합니다. 시간에 따른 초기의 산란광의 intensity 변동은 상관 계산을 통해 처리되어 상관 함수가 도출됩니다.
크기와 크기 분포를 결정하기 위해 Cumulants, NNLS, CONTIN과 같은 다양한 수학적 모델이 사용됩니다.
일반적으로 DLS 분석기는 배치 모드 (batch mode) 를 사용하며, 이는 석영 또는 플라스틱 큐벳을 이용한 전통적인 테스트 방식을 의미합니다.
이 방식은 Size Distribution 테스트에서, 특히 넓게 분포된 샘플의 경우 해상도가 낮습니다. 또한, 크기 분포에 대한 계산은 알고리즘에 매우 의존적이며,
가장 높은 해상도를 이용하여도 입자 크기가 서로 2.5 - 3배 차이가 나는 입자들만 구별이 가능할 정도로 입자 해상도가 매우 낮습니다.
반면, DLS Flow Mode 는 각 개별 입자를 detection 할 수 있는 장비를 DLS 장비 이전 단계로 연결하여 함께 사용하면 알고리즘에 의존하지 않고
개별 입자의 크기를 정확하게 감지할 수 있으며 해상도는 최대 1.3:1에 달합니다.
이 Application Note 에서는 BeNano 180 Zeta Pro 장비 앞에 SEC (Size Exclusion Chromatography) 장비를 연결하여 BSA (Bovine Serum Albumin, BSA) 샘플의 크기 분포를 확인하였습니다.
Instrumentation
BSA 용액은 PBS Buffer 에 농도 5 mg/mL 로 준비하였으며, 10분 동안 교반 후 220nm 수성 필터를 통해 filteration 하였습니다.
입자의 분리를 위해 SEC (Size Exclusion Chromatography) 장비를 BeNano 180 Zeta Pro 에 연결하였으며
분리된 개별 입자는 25°C에서 BeNano 180 Zeta Pro 에 의해 입도를 측정하였습니다.
Chromatographic Conditions :
 Mobile Phase : PBS Buffer
Flow Rate : 0.4 mL/min
Injection Volume : 100 uL
Results and Discussion
Figure 1. Intensity, RI, and Size Effluent Curves of BSA
Figure 1 에서 SEC (Size Exclusion Chromatography) 장비를 통과한 시료 샘플의 유출 곡선은 총 16mL 의 유출 부피에서 BSA 의 여러 peak 를 보여줍니다.
약 6mL 에서 나타나는 peak 는 집합체 peak 를 나타내며, 8 - 10mL 사이의 peak 는 분리된 올리고머를 나타냅니다.
마지막으로 10.5mL 에서 나타나는 주요 peak 는 BSA 의 단량체 (monmer) 를 나타냅니다. 주요 peak 의 넓은 면적은 대부분의 단백질이 단량체 상태로 존재함을 나타냅니다.
크기 유출 곡선에서 검출된 입자 크기(빨간 점)의 감소는 SEC 분리 원리와 잘 일치하며, 이는 샘플 분리에 있어 SEC 전면 장치의 효율성을 확인시켜 주고,
BeNano가 검출기로서 각 유출 성분의 입자 크기 정보를 효과적으로 얻을 수 있음을 입증합니다.
Figure 2. Intensity Distribution Curve of BSA (Bar Chart)
Figure 3. Intensity Distribution Curve of BSA (Line Chart)
Figures 2 와 Figures 3 은 크로마토그래피 effluent curve 를 intensity distribution curve 으로 변환한 것으로 분리된 올리고머를 명확하게 식별하며, 단량체는 7.21nm 에서 확인되었다.
이는 BSA 단량체의 이론적 크기 (~7nm) 와 매우 잘 일치합니다. 다른 유출 성분의 크기와 면적은 Table 1에 나와 있습니다.
Table 1. Measured distribution Peaks of BSA
Figure 4. Batch-mode detection of intensity distribution curve of BSA
batch-mode detection 에서의 intensity distribution curve (Figure 4) 는 두 개의 peak 만을 나타냅니다. 작은 peak (약 10nm)는 단량체, 이량체, 삼량체 및 기타 올리고머의
크기 분포에 해당하며, 큰 peak (약 100nm) 는 더 큰 집합체를 나타냅니다.
Figure 5. Comparison between batch-mode (line chart) and flow mode (bar chart) intensity distribution curves
Figure 5 에서 flow mode 와 batch-mode 의 detection 결과를 비교한 결과, flow mode 는 작은 크기의 peak 내에서 매우 작은 크기 차이를 가진 올리고머 성분들을 성공적으로
구별할 수 있음을 보여줍니다.
Conclusion
입자를 분리 시키는 장치를 BeNano 장비 전단계에 연결하여 flow mode 로 사용하는 BeNano 는 입자 검출기로 사용되어 크기 측정의 해상도를 크게 향상시킬 수 있습니다.
SEC (Size Exclusion Chromatography) 와 연결한 BeNano 180 Zeta Pro 를 이용하여 BSA 의 입도를 분석한 이 Application Note 결과를 통해 이러한 BeNano Flow Mode 의
검출능력이 입증되었으며, 고해상도 크기 측정 분야에서 탁월한 잠재력이 있다는 것을 보여주었습니다.
Sample Cell for DLS Flow Mode
Gel Chromatography and BeNano Nanoparticle Size & Zeta Potential Analyser
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