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Introduction
CAR-T 면역치료제는 여러 악성 암 치료에 대해 긍정적인 효과가 나타나고 있다.
2017년 이후로 다음 3종류의CAR-T 세포 치료제가 승인되었으며 현재 100개 이상의 기업들이
CAR-T 치료제를 개발하고 있는 것으로 알려져 있다.
1. Kymriah™ for B-cell precursor acute lymphoblastic leukemia in 2017 and for relapsed
or refractory large B-cell lymphoma in 2018
2. Yescarta™ for relapsed or refractory large B-cell lymphoma in 2017
3. Tecartus™ for relapsed or refractory mantle cell lymphoma in 2020
여기서는 Sartorius 사의 T-Cell Expansion Solution 은 aurologous CAR-T expansion 개발과 제조에 매우 효과적이라는 것을
확인하고자 한다.
Sartorius 사의 T-Cell Expansion Solution 은 다음과 같이 이루어 져 있으며 매우 경제적이며 효과가 탁월하고
항상 일정한 T-cell expansion 을 가능하게 한다.
- Sartorius Biostat® RM TX Twin bioreactor
- Flexsafe® RM TX bag
- 4Cell® Nutri-T medium
Material & Methods
Materials
- Biostat® B Twin controller unit
- Biostat® RM TX Twin system
- Flexsafe® RM TX bags (2L) with perfusion membrane and single-use pH and DO sensors
- 4Cell® Nutri-T mediu
Cells
Human primary T-cells 은 냉동보관된 PBMC (peripheral blood mononuclear cell, donor 1 & donor 2) 를 이용하였으며 이 cell 을 해동시킨 후
T-cell culture medium (4Cell® Nutri-T medium supplemented with 600 U/mL IL-2) 에서 37℃ 5% CO₂ incubator 에서
2 x 10^6 cells/ml cell density 로 seed culture 하였다. 그 다음날 세포를 new flask 에 옮긴 후 1 x 10^6 cells/ml cell density 에서
1:100 TransActTM 을 이용하여 세포를 activation 하였다.
Transduction
24시간 activation 한 후 anti-CD19 CAR 와 truncated form of the epidermal growth factor receptor (EGFRt) 를 coding 하는 VSV-G pseudotyped lentiviral vectors 를 T-cell 에 transduction 하였다.
EGFRt 는 transduction marker 로 사용된다.
Lentivirus infection 이틀 후 배양 medium 을 새 medium 으로 갈아주었다.
CAR T-cell expansion in the Biostat® RM TX Twin system
Two donors 의 cell 을 이용하므로 두 개의 세포를 동시에 가동할 수 있는 Biostat RM TX Twin bioreactor system 을 사용하였으며 여기에 사용되는 culture bag 은
1.2㎛ perfusion membrane 을 장착한 Flexsafe RM TX 일회용 2L bag 을 사용하였고 또한 일회용 pH & DO 센서를 이용하였다.
Seed culture 된 T- cell 을 0.3 Liter 의 4Cell® Nutri-T medium (supplemented with
600 U/mL IL-2) 에 0.5 x 10^6 cells/ml 의 density 로 inoculation 하였다.
하루와 이틀 뒤에 각각 총 volume 이 0.6L, 1.0L 가 되도록 medium 을 추가하였다.
3일째부터 5일째까지 4Cell® Nutri-T medium 를 이용하여 600ml/d 이 되도록 perfusion 을 시행하였다.
Determination of transduced cells
배양된 세포 중에 lentivirus 에 infection 된 Transduced cell 이 어느 정도인지 확인하기 위해 anti-human EGFR phycoerythrin - conjugated antibody 를 이용하여 확인하였다.
Cell count & viability measurement
Trypan blue 방법을 이용하여 transduced세포수와 viability 를 측정하였다.
Results
Monitoring of CAR-T expansion
배양 5일이 지난 후 two donor 의 total cell density 는 7.7 - 7.8 x 10^9 cells/L 가 되었고 Viability 는 90% 이상이 되었다.
이는 세포들이 bioreactor 의 rocking motion 에 잘 적응하였고 또한 실행한 process parameter 와 feeding regime 이
cell viability 의 회복에 효과가 좋았다는 것을 의미한다.
배양된 세포에서 CAR-T cell 의 수를 측정한 결과 배양 5일째에 donor 1 은 1.5 x 10^8 이고 donor 2 는
5.2 x 10^7 로서 donor 1 의 CAR-T cell 이 donor 2 보다 약 3배 더 많았다. 이는 donor 1 에서의
transduction efficiency 가 더 좋았기 때문일 것으로 생각된다.
Online monitoring of pH and DO
이 case study 에서는 5% CO2 와 95% air 조건에서 CAR-T cell 을 배양하였으며 Flexsafe RM TX single-use 2 L bag 에 장착된 pH, DO 일회용 센서를 이용하여 연속적으로 pH 와 DO 를 측정하였다
Figure 4 에서 보듯이 두 sample 의 pH, DO 변화는 유사한 패턴을 보인다.
pH 의 경우 inoculation 후 7.6까지 상승했다가 서서히 하강하여 배양 마지막 단계에서 7.2 - 7.3 에 머물렀다.
DO 는 배양 2일째까지 약간의 감소가 있는데 이것은 이 기간중에 fed-batch mode 에 공급되는 medium fed 는
DO 를 일정하게 유지하는데 충분하다는 것을 의미한다. 3일째 부터는 perfusion mode 가 시작되고 이때부터 DO 는
현저히 감소하기 시작하는데 이는 이 시기에 세포가 급격하게 증가함에 따른 DO 소모를 perfused fresh medium 이
보충하지 못하고 있다는 것을 의미한다.
결론적으로 아무것도 조절하지 않기 때문에 예상한대로 pH 와 DO 는 감소한다. 그러나 흥미롭게도
이 시간동안 세포수와 viability 는 증가세를 유지하는데 이는 적용하고 있는 parameter 가 세포 배양에
충분하다는 것을 의미한다.
Discussion
이번 case study 에서 우리는 다음과 같은 내용을 확인할 수 있었다.
Sartorius T-Cell Expansion Solution 은 CAR-T cell 을 성공적으로 expansion 하였다.
초기 inoculation 할 때에 cell viability 가 55-65% 로 낮은 상태였지만 expansion 을 할 때에는 90% 이상의 cell viability 를 보였다.
장착되어 있는 일회용 optical pH & DO sensor 는 expansion 전 과정에서 pH 와 DO 를 연속적으로 monitoring 할 수 있었다.
초기에는 pH 와 DO 의 감소가 있었지만 cell number 와 viability 는 성공적으로 유지 되었다.
Conclusion
Sartorius T-Cell Expansion Solution 은 CAR T-cell expansion 시스템 개발에 매우 효율적이고 사용이 매우 편리한 solution 이다.
T-cell yield 는 임상에 적합한 1 x 10^8 이상이었다
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