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Introduction
오늘날 세포배양에 널리 사용되고 있는 일회용 bioreactor 는 stirred single use bioreactor, airlift bioreactor 그리고 paddle mixed bioreactor 등
다양한 형태가 있는데 이 중에서 rocking motion system 또는 wave-induced motion (WIM) system 이 개발된 후 10년 넘게 가장 많이 사용되고 있다.
최초의 wave bioreactor 는 스위스 Wave Biotech 사가 개발한 BioWave 이며 Sartorius Biotech 사가 2007년 이 회사를 인수한 이후 BIOSTAT RM (figure 1, left)
이름으로 전세계로 공급되고 있다.
최근 2세대 rocking motion bioreactor 인 BIOSTAT® RM II (figure 1, right) 가 개발되었는데 이 bioreactor 는 많은 새로운 기능을 탑재하고 있으며
drive system 과 온도 조절 시스템은 기능이 더욱 향상되었다.
글로벌 바이오.제약 기업인 Merck 사의 자회사인 Werthenstein BioPharma 사는 cell cultivation 공정을 매우 많이 수행하는 업무상 필요에 의해 BIOSTAT® RM II
에 대한 성능 검증을 시행하였다.
Aim of the study
2세대 BIOSTAT® RM II 주요 특징 중 하나는 drive system 이 대폭 개선되었는데 그것은 rocking platform 에 toothed belt 로 연결된 servo motor 를 장착하였다는 것이다.
이 servo motor 에 의해 rocking angle 을 매우 정밀하게 전자적으로 조절하는 것이 가능해 졌으며 설정된 rocking angle 이 항상 일정하게 재현되므로
cell cultivation 결과가 항상 일정하게 나온다는 큰 장점이 있다.
또한 2세대 BIOSTAT® RM II 에는 air 와 CO₂ mixing 을 해주는 gassing module 이 장착되어있다.
Werthenstein BioPharma 사는 1세대 rocking motion bioreactor 인 BioWave 20 SPS 모델과 2세대인 BIOSTAT® RM II 를 동일한 조건에서 mammalian CHO cell 을 배양하여
그 성능을 비교하였다.
Materials
- Raw Material
- CHO K1 cell line
- SAFC CHO standard medium
- Supplements such as 200mM L-Glutamine Solution etc.
- Single Use Bioreactor Systems
- Sartorius Biotech BioWave® 20 SPS
- Sartorius Biotech BIOSTAT® RM II 20 basic
- Disposable Bioreactor Bag
- Sartorius Biotech CultiBag RM 10 L basic and RM 20 L basic
- Analytical Devices for Inprocess-Control
- Cedex HiRes (Roche Diagnostic) : Cell Counting
- ABL-5 (Radiometer) : pH, pCO₂, pO₂
- Bioprofile Flex (Nova) : Glucose, Lactate, Glutamine, Glutamate, Ammonia
- Disposable Shake Flask (Corning)
- Biosafety Cabinets
- CO₂ Shaker Incubator (Kuhner)
Methods
Preculture : CHO seed culture 를 하였으며 disposable shake flask 를 이용하여 scale up 을 하였다.
Cultivation #1
일회용 bag 인 CultiBag RM 20 L basic (최대 working volume 은 10 Liter) 을 rocker 인 BIOSTAT® RM || 20 basic system 에 설치하고
cell density 가 4.5 x 10^5 cells/ml 인 2 Liter 세포를 bag 에 넣고 다음과 같은 조건에서 세포배양을 시작한다.
- Aeration 5% CO₂/air gasmix, controlled by the bioreactor
- Gas flow : 100 ml/min
- Temperature : 37.0 ℃
- Rocking angle : 8 °
- Rocking speed : 11 - 12 rpm
2일간의 배양 후 fresh media 와 supplements 를 추가로 넣어 총 8 Liter final culture volume 이 되도록 한다 (1:4 dilution). 매일 시료를 채취하여
pH, metabolites, cell density 그리고 viability 를 측정하면서 4일간 추가로 배양한다.
Cultivation #2
2개의 CultiBag RM 10 L basic (최대 working volume 은 5 Liter) 을 하나의 BIOSTAT® RM || 20 basic rocker 에 동시에 설치하고 cell density 가 5 x 10^5 cells/ml 인
2 Liter 세포를 2개의 bag 에 각각 넣고 cultivation #1 과 동일한 조건에서 세포배양을 시작한다.
2일간의 배양 후 fresh media 와 supplements 를 추가로 넣어 각각 총 5 Liter final culture volume 이 되도록 한다 (1:2.5 dilution).
2개의 배양 bag 으로부터 매일 시료를 채취하여 pH, metabolites, cell density 그리고 viability 를 측정하면서 4일간 추가로 배양한다
Cultivation #control batch using the previous generation bioreactor
하나의 CultiBag RM 20 L basic (최대 working volume 은 10 Liter) bag 을 1세대 rocking system 인 BioWave 20 SPS (최대 working volume 은 10 Liter) 에 설치하고
cell density 가 4 x 10^5 cells/ml 인 2 Liter 세포를 bag 에 넣고 cultivation #1 과 #2 에서 사용한 조건과 동일한 조건에서 세포배양을 시작한다.
2일간의 배양 후 fresh media 와 supplements 를 추가로 넣어 총 8 Liter final culture volume 이 되도록 한다 (1:4 dilution). 매일 시료를 채취하여
pH, metabolites, cell density 그리고 viability 를 측정하면서 4일간 추가로 배양한다.
Results
이 실험의 목적은 2세대 rocking motion bioreactor 인 BIOSTAT® RM II system 이 1세대 bioreactor 인 BioWave 20 SPS 에서의 결과 동일하다는 것을 증명하는 것이다.
Graphics
Figure 1 은 배양 #1, #2, #control batch 의 시간에 따른 viable cell density 를 보여주고 있는데 BIOSTAT® RM II system 을 이용하는 #1, #2 의 cell density 는
BioWave 20 SPS 를 이용하는 #control batch 의 cell density 와 거의 유사하다는 것을 알 수 있다. 그래프에서 약간의 차이가 나타나는 것은 deeding density 가 약간 다르기 때문이다.
Figure 2 는 #1, #2, #control batch 의 시간에 따른 glucose 와 lactate 의 농도 변화를 나타내는데 BIOSTAT® RM II system 의 세포 배양 성능은 BioWave 20 SPS 와 거의 동일하다는 것을 알 수 있다
Conclusion
사용이 편리하고 간단하며 또한 재현성이 좋은 BIOSTAT RM 은 mammalian cell 의 배양에 가장 이상적이라 할 수 있다.
Touch screen panel 을 터치하여 control 하므로 조작이 매우 편리하다.
CO₂ gasmix 가 내장되어 외부의 gas mixing system 의 도움없이 직접 편리하게 CO₂ 를 매우 정확하게 조절할 수 있다.
이 실험을 통해 최신 버전인 BIOSTAT® RM rocking bioreactor 는 세포를 성장시키는 능력과 cell density 를 증가시키는 능력이 매우 탁월하다는 것을 알 수 있었다.
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