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Introduction
포유동물세포와 같이 곤충세포도 post-translational modification 과 protein folding 등을 할 수 있는 eukaryotic protein 을 만들 수 있다.
가장 널리 사용되는 곤충세포는 Sf9 (Spodoptera frugiperda ovary cell) cell 로서 suspension 과 adherent growth 둘 다 가능한 세포이다.
Baculovirus expression system 을 이용하여 Sf9 cell 에서 다양한 종류의 recombinant protein 을 생산할 수 있다.
BIOSTAT® RM optical (Figure 1) 은 rocking motion technology 를 이용하는 가장 진보된 기술을 기반으로 하는 일회용 바이오리액터이다.
Bag 형태의 cultivation chamber 는 좌.우로 움직여 wave mixing 을 일으키는데 매우 부드러운 shear 를 세포에 가하게 된다.
이로 인해 bag 속의 liquid 표면에서 mass transfer 가 매우 효율적으로 일어나게 된다.
일회용 bag 은 제약용 grade 인 ethyl vinyl acetate (EVA) membrane 이 다층으로 이루어 져 있다.
여기서는 일회용 Cultibag RM system (현재는 Flexsafe® RM system 으로 이름이 바뀜) 이 어떻게 효율적으로 Sf9 cell line 을 배양하는지 살펴보고자 한다.
Materials & Methods
Serum-free sf-900-II SFM media 에서 Sf9 cell line 을 배양하였다.
Cultibag RM 2 L Optical bag (DBO002L) 에 media 800ml 를 넣은 후 air 를 이용하여 bag 을 부풀렸다.
그리고 DO 와 pH 센서를 각각의 port 에 꽂은 후 분당 8 rock 속도로 2시간 동안 equilibration 하였다.
Pre-culture 한 Sf9 cell 을 seeding density 가 0.7 x 10^6 cell/ml 이 되도록 equilibration 을 한 bag 에 seeding 하였다.
Bag 의 온도는 28℃, DO 는 60%, pH 는 6.2 그리고 rocking 속도는 18~25, rocking 각도는 6° 로 설정하였다.
매일 5ml sample 을 채취하여 trypan blue exclusion method 를 이용해 viable cell density 를 측정하였으며 또한 glucose 소비율과 lactate 생성률도 측정하였다.
Results
배양 9일째에 최대 cell density 11.87 x 10^6 cells/ml 을 구하였고 cell viability 는 9일 이후에 감소하기 시작하여 12일째에 50% 로 급감하였다.
Glucose 는 배양중에 10.2 mg/ml 에서 9일째 4 mg/ml 으로 지속 감소하였으며
Lactate 의 총생성량은 배양 마지막일 10.2 mg/ml 였다.
그 후 10 L Cultibag RM bag 을 이용하여 5 L media 을 넣고 scale up cultivation을 하였으며 최대 cell density 는 2 L Cultibag RM bag 에서와 유사하게
12.9 x 10^6 cells/ml 값을 구하였다.
Discussion
DO (dissolved oxygen) 는 60% 로 설정하였으며 편차는 ±5% 이다.
DO 조절은 nitrogen, gas flow, oxygen 을 이용하여 조절하였으며 cascade mode 로 조절하였다.
Oxygen 은 세포가 log phase 성장기로 진입한 이후에 DO 를 조절하는데 사용된다. air 를 연속으로 공급하는 것보다 oxygen 을 간헐적으로
공급하는 것이 media 증발을 감소시킬 수 있다.
pH 는 6.2 로 조절하는데 0.1 N NaHCO3 와 CO₂ 를 이용하여 cascade mode 방식으로 조절한다. 배양초기에는 CO₂ 가 필요없으나 배양 마지막단계로 가면 갈수록
노폐물이 많아지면서 pH 가 상승하게 되는데 이 때 CO₂ 를 이용하여 pH 를 조절한다.
Rocking Speed
Rocking speed 는 배양액의 용량과 cell density 에 따라 결정된다.
배양 bag 의 최대 working volume 의 20-30% 정도를 배양한다면 mixing 을 위한 rocking speed 는 15 rocks 면 충분하다.
만약 최대 working volume 100% 용량으로 배양하거나 cell density 가 많을때에는 18-25 rocks 속도로 rocking 하는게 좋다.
Sf9 cell 을 2L 또는 10L Cultubag RM system 에서 배양할 경우에는 rocking speed 를 18 - 23 정도로 하면좋다.
Rocking Angle
배양 초기에는 rocking 각도를 6도로 하는 것이 적당하다.
일반적으로 세포의 산소요구량이 증가하면 rocking 각도도 증가하는 게 좋다.
Cultubag RM bag 에서 허용되는 최대량으로 배양용액을 이용하면 6° - 10° 범위에서 사용하면 된다.
2L 또는 10L Cultubag RM bag 의 경우에는 6° rocking 각도가 적당하다.
Aeration Rate
DO 는 nitrogen, air 그리고 oxygen 을 이용하여 cascade mode 방식으로 조절된다. Air flow 는 50 ~ 300ml/min 범위에서 조절되고 nitrogen 과 oxygen 은
100% 로 하여 조절에 사용된다. DO 는 60% 유지하는 것이 적당하다.
Conclusion
여기서 우리는 일회용 바이오리액터인 BIOSTAT Cultibag 20 RM 이 serum free chemically defined media 에서 Sf9 cell 을 효율적으로 배양할 수 있다는 것을 확인하였다.
일반적으로 곤충세포는 mammalian cell 보다 산소를 훨씬 더 많이 필요로 하는데 BIOSTAT Cultibag RM 은 Sf9 세포의 성장을 효율적으로 해 주었다.
일회용 바이오리액터는 오늘날 R&D, 공정개발, 그리고 소용량 생산 등에서 널리 사용되고 있는 최첨단 기술이다.
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