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Mastering Thin Film Hydration Method for Liposome and Lipid Nanoparticle Formulation |
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Author : Robin Oliverse | 리스트돌아가기 | |
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Thin Film Hydration, the genesis of liposomes and Lipid nanoparticles
비바이러스성 약물 전달 분야에서 Thin Film Hydration Method 는 표적 약물 전달을 위한 리포좀 또는 지질 나노입자 (LNP) 와 같은 기타 지질 기반 나노입자를 제조할 수 있는 최초의 이용 가능한 방법이었기 때문에
초석이 되었습니다. Bangham 법 또는 지질 막 수화법 (Lipid Film Hydration Method) 이라고도 알려진 이 합성 기술은 친수성 또는 소수성 API (원료의약품), 소형 약물, 펩타이드, 단백질, RNA 등
다양한 화합물을 캡슐화하는 데 사용 용이성과 효능 덕분에 약물 전달 접근 방식에 혁명을 일으켰습니다.
리포좀과 지질 나노입자는 서브미크론 크기 (일반적으로 50~500nm) 의 다재다능한 운반체로 돋보입니다. 리포좀은 하나 이상의 속이 빈 인지질 이중층 막으로 구성되어 수성 소포를 가두는 반면,
지질 나노입자 (LNP) 는 고체 지질 매트릭스가 특징입니다. 이러한 독특한 구조는 리포좀의 약물 또는 LNP 의 올리고뉴클레오티드, RNA, DNA 등과 같은 API 를 캡슐화하는 고유한 기능을 제공합니다.
특히, 이들은 뛰어난 생체 적합성, 높은 캡슐화 효율 및 우수한 약물 방출 능력을 제공하여 표적 약물 전달을 위한 핵심 자산이 됩니다.
이 방법은 사용 용이성, 광범위한 가용성 및 비용 효율성으로 인해 많은 실험실에서 널리 인기를 얻었습니다. 그러나 확장성이 낮고 최종 나노입자 특성에 대한 일관된 제어를 달성하기 어렵고
종종 재현성이 부족하여 생물학적 응용 분야에서 최적의 성능을 내지 못하는 경우가 많다는 어려움이 있습니다.
이러한 이유로 박막 수화 공정은 수년간 지속적으로 개선되어 왔으며, 나노입자 결과에 대한 훨씬 더 정밀한 제어를 가능하게 하는 동시에 더 높은 처리량을 허용하는 새로운 나노입자 합성 방법으로 이어졌습니다.
이러한 혁신은 최신 세대의 리포좀 및 LNP를 표적 전달 또는 치료-진단(theranostic) 응용 분야에 이상적인 도구로 만들고 있습니다.
Preparation of Liposome or Lipid-based nanoparticle by thin-Film Hydration Method
Thin Film Hydration 을 이용한 리포좀 제조 공정은 유기 용매에 지질을 녹이고, 용매를 증발시켜 플라스크에 얇은 지질 막을 형성한 다음, 이 막을 수용액으로 수화시켜 나노입자 형성을 유도하는 과정을 포함합니다.
이 공정에는 지질 선택, 용매 종류, 수화 매개변수 등 수많은 중요한 요소들이 영향을 미칩니다. 이 과정을 더 잘 이해하기 위해 단계별 공정을 자세히 살펴보겠습니다.
Selection of Lipids
이 과정의 첫 번째이자 가장 중요한 단계 중 하나는 리포좀 제형에 적합한 지질을 선택하는 것입니다. 실제로 지질의 선택은 크기, 약물 캡슐화 효율
(즉, 약물 함량) 부터 세포 섭취 및 생체 분포에 이르기까지 거의 모든 최종 나노입자 특성을 결정합니다. 일반적인 리포좀 제형에는 대두 포스파티딜콜린
(soy phosphatidylcholine, SPC), 콜레스테롤 (cholesterol, Chol), PEG (polyethylene glycol) 및 응용 분야에 따라 다른 특정 지질들이 포함됩니다.
PEG 의 예에서 볼 수 있듯이, 지질의 비율은 매우 중요합니다. PEG의 농도는 일반적으로 0.5% 에서 3% 사이이며, 이 변화는 나노입자 또는 리포좀의 크기를
거의 3분의 1로 줄일 수 있습니다.
Dissolution of Lipids in an organic solvent
두 번째 단계는 유기 용매, 일반적으로 클로로폼 또는 클로로폼-메탄올 혼합물에 지질을 녹여 지질 현탁액을 얻는 것입니다. 그럼에도 불구하고 순수한 에탄올이나
메탄올과 같이 덜 가혹한 용매를 사용할 수 있습니다. 일반적으로 다음 단계를 용이하게 하기 위해 둥근 바닥 플라스크를 사용해야 합니다.
친지질성 (lipophilic) API 와 소수성 약물 또한 이 단계에서 용매에 용해될 수 있습니다.
Formation of Thin Lipid Film
지질과 용매 혼합물이 녹으면 rotary evaporator 로 옮겨야 합니다. 이를 사용해 감압 하에서 유기 용매를 완전히 증발시켜 플라스크 바닥에 얇은 지질 막을 형성합니다.
증발 후, 잔류 용매를 제거하기 위해 얇은 막을 진공 하에서 몇 시간 동안 건조해야 합니다.
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Ionizable lipid formula for Lipid Nanoparticle
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Hydration of Lipid Film
이 공정의 다음 단계는 건조된 지질 막을 증류수, 완충 용액 또는 친수성 API 를 포함하는 식염수와 같은 적절한 수용액상으로 수화시키는 것입니다.
높은 상전이 온도(Tc)를 가진 지질을 사용할 경우, 수화 매체를 미리 가열할 수도 있습니다.
지질과 수용액상을 접촉시키면 리포좀의 자가 조립(self-assembly) 과정이 시작되어 다중층 소포(multilamellar vesicles, MLVs)가 형성됩니다.
Post-processing step: Purification
Formation Process 후, 캡슐화되지 않은 약물과 오염물질 같은 물질들이 종종 주변 액체에 남아 있습니다. 후처리 공정의 또 다른 핵심 요소는 공정에 사용된 잔류 유기 용매를 제거하는 것입니다.
이러한 용매가 최종 제품에 남아 있으면 리포좀을 불안정하게 만들고 사용에 위험할 수 있기 때문입니다.
따라서 이러한 물질들은 추가적인 정제 (purification) 단계를 통해 제거해야 합니다. 이를 제거하기 위한 일반적인 기술로는 접선 흐름 여과 (tangential flow filtration),
초원심분리 (ultra-centrifugation), 투석 (dialysis) 등이 있습니다. 그러나 이러한 정제 과정은 시간이 많이 소요될 수 있으며, 리포좀의 최종 수율을 감소시키는 동시에
최종 나노입자의 특성에 상당한 영향을 미칠 수 있습니다. |
Characterization of the liposome product
LNP 및 리포좀 특성 분석에 대한 우리의 검토에서 설명했듯이, 입자 크기, 다분산성, 표면 전하, 약물 탑재량 및 캡슐화 효율과 같은 수많은 매개변수들은 LNP 제조 방법에 영향을 받습니다.
DLS 와 같은 첨단 분석 기술은 이러한 특성들을 측정하는 데 사용되며, 생물학 및 제약 응용 분야에서 리포좀 및 LNP의 품질과 적용 가능성을 보장합니다.
Nanoparticle size
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일반적으로 나노입자는 50nm에서 500nm까지 다양한 크기를 가지지만, 최적의 표적 크기는 50nm에서 150nm 범위 내에 있습니다.
이 크기 범위는 세포 섭취를 향상시키고 면역 체계의 제거를 회피하여 혈류 내 순환 시간을 연장하는 데 선호됩니다.
위에서 언급했듯이, 입자 크기는 일반적으로 지질 비율과 농도에 영향을 받습니다. 박막 수화 기술을 사용하여 얻은 나노입자와 리포좀은 다소 크고(수백 μm)
따라서 추가적인 후정제 단계가 필요합니다.
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Illustration of Size and PDI when measured with a DLS
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Polydispersity Index
다분산 지수(PDI, Polydispersity Index)는 리포좀 집단의 균일성을 측정합니다. FDA 지침에 따르면, 의약품의 PDI는 0.3 미만으로 유지되어야 합니다.
이는 일반적으로 0.3에서 0.5 사이의 PDI를 생성하는 지질 수화법의 중요한 한계입니다. 따라서 이러한 기준을 충족하기 위해서는 압출(extrusion)과 같은 추가적인 정제 단계가 필요할 수 있습니다.
Zeta potential
리포좀 제타 전위 (zeta potential) 는 리포좀 구조 표면 근처의 전하를 측정하는 것입니다. 제타 전위는 나노입자의 안정성과 독성 모두에 영향을 미치는데, 낮은 제타 전위는 낮은 안정성과 응집 위험을 의미하며,
너무 높은 제타 전위 값은 독성을 유발합니다. 일반적으로 제타 사이저 (Zeta sizer) 를 사용하여 측정하며, 그 값은 -30mV 와 30mV 사이에 유지되어야 합니다.
제타 전위에 영향을 미치는 주요 매개변수는 나노입자의 조성입니다.
Structure and morphology
리포좀은 지질 이중층으로 둘러싸인 소포체의 수에 따라 다양한 형태를 취할 수 있습니다. 이러한 변형에는 단일막 소포 (unilamellar) 와 양파 같은 구조를 가진
다중막 소포 (multilamellar vesicles, MLVs) 가 있으며, 각각 고유한 배열과 구성을 통해 구별됩니다. 형태를 정밀하게 특성화하기 위해 투과전자현미경 (TEM) 또는 이의 개선된 버전인
저온 투과전자현미경 (Cryo-TEM) 이 필수적이고 매우 효과적인 도구로 사용됩니다.
Encapsulation efficiency
캡슐화 효율 또는 entrapment efficiency 은 초기에 사용 가능한 약물의 양에 대한 로딩된 약물의 비율을 나타냅니다. 따라서 사용된 약물의 특성과 지질 구성에 크게 좌우됩니다.
Pro and cons of the Banger method (Thin-Film Hydration method)
Banger method 의 장단점을 요약하면 다음과 같습니다.
| Advantages |
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Drawbacks and Limitations: |
| 1. |
Ease of Access and Cost-Effectiveness : Bangham method 는 주로 대부분의 실험실에서 쉽게 구할 수 있는 표준적인 실험실 장비를 활용하기 때문에, 리포좀 제형을 위한 접근성이 좋고 비용이 저렴한 방법입니다. |
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| 2. |
Reduced Solvent Contact : 유기 용매가 수용액과 접촉할 때 거의 완전히 제거되므로, 친수성 활성의약성분 (API) 또는 약물 제품이 용매에 노출되는 것이 최소로 이루어집니다. |
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| 1. |
Challenges in Solvent Removal : 유기 용매를 완전히 제거하는 과정이 시간이 많이 걸려 합성 시간이 매우 길어질 수 있습니다. |
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| 2. |
Colloidal Stability and Entrapment Efficiency : 이 방법은 종종 콜로이드의 안정성이 좋지 않아 entrapment efficiency 가 매우 일정하지 않은 경우가 많아 최종 의약품의 품질 문제를 야기합니다. |
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| 3. |
Scale Limitations : 소규모 생산에는 적합하지만, 배치당 생산량이 낮고 공정 시간이 길어대규모 생산으로 확장할 때에는 많은 어려움이 따른다. |
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| 4. |
Poor repeatability : auto-assembly 공정 중 관련 parameter 들의 제어가 어려워 batch 간 재현성이 매우 낮아 제약공정에 한계가 있습니다. |
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How to improve the quality of liposomes produced by thin film hydration?
최종 리포좀 제형의 품질을 개선하기 위해 수많은 접근법들이 사용될 수 있습니다.
Extra post-processing steps
다른 기존의 리포좀 제조 방법들 (에탄올 주입, 에테르 주입과 같은 용매 주입법 또는 세제 제거법 등) 과 마찬가지로, 추가적인 크기 축소 또는 후처리 공정을 수행하여 리포솜 의약품의 품질을 개선할 수 있습니다.
비록 방법은 다르지만, 이 모든 방법들은 나노입자 크기를 줄이고 나노입자 집단을 균질화하기 위해 동일한 접근법을 사용합니다.
즉, 높은 에너지를 사용하여 나노입자를 더 작고 균일한 입자로 분해하는 것입니다.
Sonication Method
초음파 처리법은 초음파 에너지를 사용하여 다층 리포좀 (MLV) 용액으로부터 더 작은 소포를 만드는 방법으로, 일반적으로 불활성 분위기에서 수행됩니다.
그러나 이 방법은 더 작은 리포좀을 만드는 데 널리 사용되지만, 생물학적 응용과 같이 정밀한 물리적 특성이 필요한 리포좀에는 이상적이지 않을 수 있습니다.
Extrusion Method
Extrusion Method 는 특정 구멍 크기를 가진 막 (membrane) 을 통해 리포솜 용액을 강제로 통과시키는 것으로, 종종 인지질의 상전이 온도보다 높은 온도에서 수행됩니다.
그 결과, 리포좀의 크기가 줄어들고 크기 분포가 좁아집니다.
일관되고 재현성 있는 리포좀을 생성하는 것으로 알려져 있지만, Extrusion Method 또한
제품 손실, 제한된 작동 부피, 그리고 높은 압력과 온도가 수반되어 API (활성 의약 성분) 품질을 변화시킬 수 있습니다.
High-Pressure Homogenization Method
High-Pressure Homogenization 공정에서는 초기 리포좀 현탁액에 강한 압력을 가합니다. 이 고압 환경은 현탁액 내 공동화 (cavitation), 전단력, 그리고 난류의 결과로 리포좀 크기를 줄입니다.
결과로 생성되는 리포좀은 가해지는 압력, 공정 중의 온도, 그리고 공정 주기의 횟수를 포함한 여러 핵심 요소에 의해 영향을 받습니다.
하지만, 이 기술에는 몇 가지 어려움이 있습니다. 주요한 문제점 중 하나는 매우 높은 압력을 필요로 한다는 점인데, 이는 달성하고 유지하기가 어려울 수 있습니다.
또한, 금속 및 오염 물질로 인한 오염 위험이 있어 리포좀의 순도와 품질을 손상시킬 수 있습니다.
Microfluidics : A Cutting-Edge Approach Surpassing Thin Film Hydration for Liposome and LNP Synthesis
마이크로유체역학 (Microfluidics) 은 리포좀 및 지질 나노입자 제형을 위한 기존의 전통적인 접근법에 비해 우월한 대안으로 부상했습니다.
이 최첨단 기술은 입자 크기에 대한 탁월한 제어, 감소된 가변성, 더 높은 캡슐화 효율, 그리고 더 나은 확장성을 제공합니다.
이로 인해 마이크로유체역학은 나노입자 제조에서 가장 진보되고 효율적인 방법으로 자리매김하고 있습니다.
Summary table of the LNP, nanoparticles and liposomes formulation methods
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일반적으로 나노입자는 50nm에서 500nm까지 다양한 크기를 가지지만, 최적의 표적 크기는 50nm에서 150nm 범위 내에 있습니다.
이 크기 범위는 세포 섭취를 향상시키고 면역 체계의 제거를 회피하여 혈류 내 순환 시간을 연장하는 데 선호됩니다.
위에서 언급했듯이, 입자 크기는 일반적으로 지질 비율과 농도에 영향을 받습니다. 박막 수화 기술을 사용하여 얻은 나노입자와 리포좀은 다소 크고(수백 μm)
따라서 추가적인 후정제 단계가 필요합니다.
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Limitations of the current methods for the control of nanoparticle characteristics
기존의 Top-Down 리포좀 생산 방법은 일반적으로 지질을 함유한 용매를, 활성 의약 성분 (API) 을 포함하는 반대 용매 (보통 물) 와 혼합하는 것을 포함합니다.
이 두 용액 사이의 상호작용은 self-assembly process (also known as nanoprecipitation) 을 통해 나노입자 합성을 유발합니다.
결과적으로, 혼합 조건이 최종 나노입자의 특성에 중요한 영향을 미칩니다. 일관된 혼합 및 재현성을 배치 간 그리고 단일 샘플 내에서 모두 달성하는 것은
최적의 크기 제어와 배치 간 일관성을 갖춘 균질한 나노입자 집단을 얻는 데 매우 중요합니다.
Introduction to nanoparticle synthesis by microfluidics
마이크로유체역학은 sub-millimeter scale 에서 액체를 조작하는 과학으로, 이 분야에서 중요한 도구로 떠오르고 있습니다.
이러한 scale 에서 유체는 층류 특성을 보이며, 이는 매우 정밀하게 제어되고 재현성 있는 유체 조건을 가능하게 합니다.
이러한 예측 가능성은 혼합 조건을 일관되게 제어하는 핵심이며, 결과적으로 최종 나노입자의 특성을 정확하게 결정할 수 있도록 합니다.
특히, 마이크로유체역학은 최종 제품에 대한 제어력을 향상시킬 뿐만 아니라, 높은 처리량 (분당 수십 밀리리터까지) 을 제공하여 작업 시간을
현저히 단축 (배치당 1분 미만) 시키고 스크리닝 공정을 크게 가속화합니다.
Characteristics of nanoparticles obtained with microfluidics
마이크로유체역학은 모든 중요한 나노입자 특성에 대한 제어 및 품질을 향상시킵니다.
Size and PDI : 우수한 혼합 제어는 균질한 나노입자 집단 (PDI <0.2), 탁월한 크기 제어, 그리고 배치 간 5% 이상의 뛰어난 재현성을 보장하여, 제약 나노입자 합성에 이상적입니다.
Encapsulation Efficiency : 마이크로유체역학은 비할 데 없는 캡슐화 효율을 달성하며, 예를 들어 RNA-LNP 캡슐화에서 최대 98% 에 이릅니다.
Practical Implementation
마이크로유체 시스템은 일반적으로 두 가지 주요 구성 요소로 이루어져 있습니다. 직경 5~500 μm 범위의 채널을 가진 마이크로유체 칩과, 시린지 펌프 또는 첨단 압력 기반 시스템과 같은 유량 제어 시스템입니다.
헤링본 믹서 (herringbone mixer) 와 같은 첨단 디자인을 포함한 마이크로유체 칩의 설계는 혼합 조건에 직접적으로 영향을 미쳐, 유량 조절을 통해 재현성, 고속 합성, 그리고 입자 크기의 간단한 제어가 가능하게 합니다.
이러한 장점에도 불구하고, 마이크로유체 기술은 구성 요소의 특수성과 특히 sub-milliliter 부피에서 나노입자 생산에 필요한 정밀성 때문에 복잡할 수 있습니다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 우리는 초보자도 나노입자 합성에 마이크로유체 기술을 쉽게 적용할 수 있도록 사용자 친화적인 솔루션을 제공하는 TAMARA 플랫폼을 출시했습니다.
더 자세한 정보는 TAMARA 플랫폼을 방문하십시오.
결론적으로, 마이크로유체 기술은 나노입자 생산에서 패러다임의 전환을 의미하며, 전통적인 방법들에 비해 상당한 개선점을 제공합니다.
그 정밀성, 재현성, 속도 및 확장성은 제약 및 나노기술 분야에서 매우 중요한 자산이 되게 합니다.
Microfluidics : The Historical Significance of Thin Film Hydration in Liposome and Lipid Nanoparticle Applications
thin film hydration method 를 통해 처음 제형화된 리포솜의 등장은 약물 전달 및 생물 의학 연구 분야에서 혁명적인 변화를 가져왔습니다.
1960년대 알렉 뱅엄 (Alec Bangham) 의 선구적인 연구에서 시작된 이 방법은 리포좀 생산의 기준을 세웠습니다.
이는 단일 과학적 발전이 어떻게 의학 과학 및 제약 응용 분야에서 수많은 문을 열 수 있는지를 보여주는 역사적인 이정표 역할을 합니다.
Foundation in Drug Delivery
thin film hydration method 는 친수성 및 소수성 약물을 모두 지질 이중층 내부에 캡슐화하는 혁신적인 접근법을 도입했습니다.
이 혁신은 표적 약물 전달 분야를 발전시켰고, 다양한 건강 상태에 대한 새로운 치료 가능성을 제공했습니다.
Cancer Therapy Breakthroughs
이 방법은 특히 암 치료를 위해 고안된 리포좀 약물 제형의 개발을 촉진했습니다. 연구자들은 항암 화학 요법 약물을 리포좀에 캡슐화하고 EPR (Enhanced Permeation and Retention) 효과를 활용하여
종양에 대한 표적 전달을 달성함으로써, 일반적인 항암 화학 요법과 관련된 전신 독성과 부작용을 현저히 줄였습니다. 주요한 예시로는 세포 독성 항암제인 독소루비신 (doxorubicin) 또는 독실 (doxyl) 의
첫 번째 리포좀 제형이 있습니다.
Advancements in Genetic Medicine
리포좀 연구의 발전과 마이크로유체역학 같은 지질 기반 나노입자 합성 기술의 개선은 지질 나노입자 (LNPs) 의 개발로 이어졌습니다. 리포좀의 가까운 사촌 격인 이 LNPs 는
DNA, RNA 또는 siRNA 와 같은 유전 물질을 캡슐화하기 위해 특별히 맞춤화되었습니다.
이들은 유전 질환을 교정하기 위한 획기적인 해결책, 특히 희귀 질환 치료법 개발의 문을 열었습니다.
Immunization and Vaccine Development
Thin film hydration method 으로 제형화된 리포좀은 역사적으로 백신 제형에서 중요한 역할을 수행해 왔습니다. 면역 반응을 강화하고 항원을 표적으로 전달하는 능력은
다양한 백신 개발에 결정적인 역할을 했습니다. 이는 최종적으로 코로나19 백신에서 mRNA 를 보호하기 위해 LNP (지질 나노입자) 가 사용된 것으로 정점에 달했습니다.
Cosmetic Applications
화장품 산업은 피부 치료 및 회춘을 위한 리포좀의 잠재력을 활용했습니다. 활성 성분을 표적 피부층에 직접 전달함으로써 리포좀은 스킨케어 제품 및 트리트먼트의 효능을 향상시켰습니다.
화장품 적용과 관련된 규제 제약이 낮기 때문에, Thin film hydration method 은 이 분야에서 여전히 널리 사용됩니다.
Conclusions
Thin film hydration method 은 리좀 개발의 기초를 마련했을 뿐만 아니라, 더 넓은 지질 기반 나노입자 분야의 발전을 이끌었습니다.
그러나 이 방법에 내재된 중요한 나노입자 특성에 대한 제한된 제어력은 생물학 및 제약 분야에서의 응용에 한계를 초래합니다.
그럼에도 불구하고, 이 접근법은 특히 마이크로유체역학의 등장과 같은 첨단 리포좀 생산 기술의 개발로 이어졌습니다.
이는 RNA 기반 연구의 새로운 시대를 여는 초석이 된 지질 나노입자 (LNPs) 발견에 결정적인 역할을 했으며, 새로운 암, 감염성 질병 및 희귀 질환 치료의 길을 열었습니다.
이러한 한계에도 불구하고, Thin film hydration method 의 역사적 영향은 여전히 현재의 연구를 이끌고 있으며, 이는 헬스케어 및 과학 분야에서의 지속적인 역할을 강조합니다.
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