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Using Lipid nanoparticle (LNP) for CRISPR-CaS9 Delivery |
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Author : Robin Oliverse | 리스트돌아가기 | |
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최근 생명공학의 발전은 특히 CRISPR-Cas9 기술의 도입을 통해 유전체 편집 방법을 혁신적으로 변화시켰습니다. 이 시스템은 정밀한 유전체 변형을 가능하게 하여 유전자 치료,
기초 연구 및 개인 맞춤 의학 분야에서 새로운 가능성을 열었으며, 2020년 노벨 화학상에서 입증되었듯이 의학을 혁명적으로 변화시키고 있습니다.
그러나 CRISPR-Cas9 의 임상 적용에 있어 현재 주요 과제 중 하나는 유전체 편집 구성 요소를 특정 세포에 효율적이고 표적화하여 전달하는 것입니다.
이러한 맥락에서 지질 나노입자 (LNP) 는 유망한 해결책으로 부상했으며, CRISPR-Cas9 전달 최적화에 핵심적인 역할을 하고 있습니다. 이미 mRNA 전달에서 효능을 입증한 LNP 는
CRISPR-Cas9 구성 요소에 핵산 분해로부터의 보호를 제공할 뿐만 아니라, 비표적 효과를 최소화하면서 더 표적화된 전달을 가능하게 합니다.
나노입자는 정밀한 표적화, 확장성, 편집 효율성, 낮은 면역 반응 가능성 및 뉴클레아제에 대한 감소된 민감성 덕분에 유전적 페이로드 (payload) 를 변형하도록 설계될 수 있습니다.
CRISPR-Cas9 전달을 위한 지질 나노입자에 초점을 맞춘 본 리뷰에서는 먼저 CRISPR-Cas9 시스템 발견의 중요성과 그 작동 메커니즘을 강조할 것입니다.
다음으로, 지질 나노입자 (LNP) 의 구성과 설계를 검토할 것입니다. 마지막으로, 이러한 LNP 가 CRISPR-Cas9 시스템을 전달하는 데 특히 흥미로운 방법으로 어떻게 제시되는지 분석할 것입니다.
The CRISPR (Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats) Cas9 Revolution
CRISPR-Cas9 는 유전체 편집을 더 간단하고, 빠르며, 정밀하게 만들어 생명공학에 혁명을 일으켰고, 유전자 치료, 농업, 연구 분야에서 주요하게 응용되고 있습니다.
이 기술은 유전 질환 및 감염성 질환 치료에 상당한 발전을 가져왔을 뿐만 아니라, 비용을 절감하고 과학적 발견을 가속화했습니다. 2012년 발견된 이래, CRISPR-Cas9 시스템은
가장 활발히 연구되는 분야 중 하나가 되었습니다. 실제로 2020년 노벨 화학상은 이 기술에 대한 공로로 에마뉘엘 샤르팡티에와 제니퍼 다우드나에게 수여되었습니다.
Working principle
CRISPR 이라는 약어는 원래 바이러스에 대한 방어 메커니즘으로 발견된 박테리아 유전체의 특정 영역을 지칭하며, Cas9 은 정밀한 위치에서 DNA 를 절단할 수 있는 분자 가위 (Molecular Scissors) 처럼 작용하는
CRISPR 관련 단백질을 의미합니다.
CRISPR-Cas9 working principle
CRISPR-Cas9의 기능은 RNP (Ribonucleoprotein) 복합체를 형성하는 두 가지 주요 구성 요소에 의존합니다.
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Guide RNA (gRNA) : 유전체 내 특정 DNA 서열을 표적화하도록 프로그램된 짧은 RNA 서열입니다. 이 가이드 RNA는 염기쌍 상보성을 통해 표적 서열에 결합합니다. |
| • |
Cas9 protein : 이 효소는 가이드 RNA에 의해 표적 DNA 서열로 유도됩니다. 지정된 위치에 도달하면 Cas9은 가이드 RNA가 식별한 정밀한 부위에서 DNA를 절단합니다. |
DNA가 절단된 후에는 두 가지 유형의 복구가 발생할 수 있습니다
| • |
Non-Homologous End Joining (NHEJ) : 이 DNA 복구 메커니즘은 빠르지만 종종 오류가 발생하기 쉬워, 표적 유전자를 비활성화하는 돌연변이나 유전자 파괴로 이어질 수 있습니다. |
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Homology-directed Repair (HDR) : 세포가 주형 DNA 사본을 가지고 있을 때, 새로운 유전 서열을 삽입하여 절단 부위를 복구할 수 있으며, 이는 유전적 돌연변이의 변형 또는 교정을 가능하게 합니다. |
CRISPR Delivery Approaches
위에서 설명했듯이, Cas9 구성 요소를 세포 내로 전달하는 것은 효율적인 유전자 편집에 매우 중요합니다. Cas9 단백질은 크게 DNA, mRNA, 단백질 세 가지 형태로 전달될 수 있으며,
각 방식은 고유한 장단점을 가지고 있습니다.
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Plasmid DNA 는 비용 효율적이고 준비하기 쉬우며, 더 긴 발현을 제공하여 지속적인 편집에 이로울 수 있습니다. 그러나 발현 시작이 느리고, 장기적인 발현으로 인한 표적 외 효과 및 삽입 돌연변이 위험이 우려됩니다. |
| • |
mRNA 전달 은 세포가 주형 DNA 사본을 가지고 있을 때, 새로운 유전 서열을 삽입하여 절단 부위를 복구할 수 있으며, 이는 유전적 돌연변이의 변형 또는 교정을 가능하게 합니다. |
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Protein Delivery 는 핵 내에서 즉각적인 작용을 가능하게 하여 빠른 유전자 편집에 가장 효율적이지만, 일시적인 존재와 높은 비용이 단점입니다. 또한, 박테리아 유래 Cas9 단백질은 면역 반응과 관련된 안전성 문제를 야기합니다. |
Delivery Strategies
다양한 CRISPR-Cas9 시스템 구성 요소의 세포 내 전달을 위해 아래 표에 제시된 다양한 접근법이 개발되었으며, 각 접근법은 특정한 장점과 한계를 가집니다.
Cas9 전달을 위해 고려해야 할 사항은 다음과 같습니다.
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Efficiency : Cas9 RNP 복합체의 직접 전달은 효율적일 수 있지만, 세포 내 흡수율이 낮아 systemic applications 에는 어려움이 많습니다.
바이러스 벡터는 전달을 향상시킬 수 있지만, 면역 반응 및 패키징 용량 측면에서 한계가 있습니다. |
| • |
Safety : 바이러스 벡터, 특히 렌티바이러스는 genomic integration 과 관련된 위험성이 존재합니다. 아데노바이러스는 genomic integration 문제는 해결될 수 있으나
면역 반응을 유발합니다. LNP 및 electroporation 과 같은 비바이러스성 방법은 더 안전한 대안을 제공하지만, 더 광범위한 조직 표적화를 위해서는 추가적인 optimization 과정이 필요할 수 있습니다. |
| • |
Applicability : 모든 방법이 in vitro 및 in vivo gene editing 에 사용될 수 있는 것은 아니며, gene editing system 이 세포내로 전달되는 정도는 매우 다양합니다.
효율적임에도 불구하고, electroporation 법과 같이 생체 외 (ex vivo) 에서만 가능한 방법의 경우는 세포내로 전달하는 것이 거의 블가능하게 됩니다. |
아래 표는 각 접근법의 장점과 단점을 요약합니다.
| Delivery Approach |
Viral Vectors |
Non Viral Delivery |
| AAV (Adeno-associated Virus) |
Lentivirus |
Adenovirus |
EV |
Microinjection |
Lipid Nanoparticle |
Electroporation |
| Cas9 Delivery Format |
DNA |
DNA |
DNA |
Protein |
DNA, mRNA or Protein |
DNA, mRNA or Protein |
DNA, mRNA or Protein |
| Delivery Efficiency |
Low |
Medium |
Medium |
Medium |
Low |
Medium |
High |
| Safety concerns |
Medium |
High |
Medium |
Low |
Low |
Low |
Low |
| Advantage |
Non integrating. Effective delivery of small DNA sequences. |
Efficient Delivery |
Non integrating. |
All in one format |
Didrect delivery |
Low stress, high encapsulation rates |
Efficiency delivery |
| Limitations |
Limited capacity (~4.7 kb) -> Cannot integrate large sequences. |
Risk of unwanted genomic integration. |
Strong immune response. Complex |
Production difficult, more complex approach |
Only ex vivo => Very invasive |
Requires optimization |
Only ex vivo => Very invasive |
높은 효율성 때문에 electroporation 은 생체 외 (ex vivo) 적용에 널리 사용되어 왔지만, 그 새포내 전달효율이 낮아 in vivo 작업에 실제적인 적용이 많이 어려운 상황입니다.
mRNA COVID-19 백신에서의 성공 이후, LNP 의 발전은 비바이러스성 방법으로 초점을 전환시키고 있습니다. 이제 LNP 는 CRISPR/Cas9 의 주요 전달 옵션으로 간주되며,
Beam Therapeutics 와 같은 회사들은 새로운 CRISPR/Cas9 제형에서 유망한 결과를 보고하고 있습니다.
Overview of LNPs for CRISPR/Cas9 delivery
지질 나노입자 (LNP) 는 생명공학 및 약물 전달 분야를, 특히 RNA 기반 치료제와 mRNA 백신 분야를 혁신적으로 변화시켰으며, 동시에 다른 유형의 RNA (siRNA 및 miRNA 등) 를 포함하는
유전자 치료법의 길을 열었습니다. LNP 는 RNA 를 캡슐화하여 효소적 분해로부터 RNA 를 보호하고 세포 흡수를 향상시켜, 표적 세포 내에서 RNA 안정성, 효율적인 세포질 전달 및
최적의 단백질 번역을 보장합니다.
이 기술은 naked nucleic acid 에 의해 유발되는 전달 비효율성 및 면역 반응 문제를 해결하여, 종종 탑재량 (payload) 용량과 안전성 문제로 제한되는
바이러스 벡터에 비해 상당한 이점을 제공합니다. COVID-19 mRNA 백신의 성공은 RNA 기반 치료제의 전달 및 효능을 향상시키는 LNP 의 막대한 잠재력을 분명히 보여주며,
이를 현대 의학에서 필수적인 존재로 만들었습니다.
LNP composition
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Ionizable Cationic Lipid : 이것은 핵산의 캡슐화 및 전달을 위해 LNP 를 향상시키는 중요한 역할을 합니다.
산성 pH 에서 양전하를 띠게 되어, LNP 형성 중 음전하를 띠는 핵산과 상호작용하게 됩니다. 이 특성은 캡슐화를 개선하고
표적 세포로 전달되기 전에 mRNA 또는 CRISPR/Cas9 페이로드가 분해되는 것을 방지합니다.
생리적 pH 에서는 이 지질들이 전하를 띠지 않아 면역 세포에 의한 격리를 방지하고 혈류 내 LNP 의 순환 시간을 연장합니다.
엔도사이토시스후, 산성화된 endosome 내에서 양전하가 다시 나타나 세포질로의 효과적인 payload 방출을 촉진하고
리소좀 효소에 의한 분해를 피합니다. 이러한 지질은 mRNA 및 단백질을 포함한 CRISPR/Cas9 구성 요소의 표적화되고 효율적인 전달을
가능하게 하며, 표적 외 효과 (off-target effects) 및 독성을 최소화합니다.
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LNP Lipid Nanoparticle internal composition |
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PEG Lipids : PEG lipid 는 입자 크기를 조절하고, 면역원성을 감소시키며, 체내 circulation time 을 늘려 LNP 의 안정성을 높이는 데 핵심적인 역할을 합니다.
PEG 분자가 Lipid Head 에 부착된 PEG 지질의 구조는 LNP 외부 표면에 코팅을 형성하여 제형화, 보관 및 혈류 순환 중 particle aggregation 발생을 방지합니다.
또한, 이는 면역 세포에 의한 식균 작용으로부터 LNP를 보호하여 순환 수명을 연장합니다. 이러한 특성들은 CRISPR/Cas9 분자의 표적 세포 전달을 개선하고 유전자 편집 효율을 높이는 데 기여합니다.
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Phospholipids : 인지질 (Phospholipids) 은 주로 LNP 의 외부 지질층에 존재하며, 구조적 안정성과 전달 효율을 높이는 데 사용됩니다.
다양한 인지질 조합을 LNP 제형에 추가하여 입자 크기 및 표면 전하와 같은 생물물리학적 특성을 조절함으로써 최적의 캡슐화, 안정성 및 endosome 방출을 촉진할 수 있습니다.
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Cholesterol : 콜레스테롤은 LNP 제형에서 인지질 사이의 틈을 채워 입자 안정성을 높이는 데 사용됩니다. 또한, 콜레스테롤은 양전하를 띠는 지질의 활성을 강화하고
융합 과정에서 세포막의 불안정화를 촉진함으로써 세포 흡수 시 막 융합을 돕습니다. |
LNP formulation for CRISPR-Cas9 delivery
CRISPR/Cas9 구성 요소를 탑재한 LNP 를 제조하는 데는 여러 가지 방법이 있지만, microfluidics 를 기반으로 하는 방법이 가장 효율적이고 대중적인 접근 방식으로 부상하고 있습니다.
LNP 제조를 위한 미세유체 기술의 사용은 정밀하고 소량 (마이크로리터/밀리리터 규모) 의 제조를 가능하게 하여, 값비싼 재료를 절약하면서 CRISPR/Cas9 전달을 최적화하는 데 이상적입니다.
미세유체 기술은 뛰어난 재현성과 입자 특성에 대한 제어력을 제공하여, 쉽게 최적화되고 일관된 성능을 가진 고효율 유전자 편집 제형을 만듭니다.
이 기술은 제형화 과정을 간소화하고 CRISPR/Cas9 시스템의 치료 잠재력을 향상시키는 능력 때문에 약물 개발에 필수적이 되었습니다.
또한, 미세유체기술은 수동적 (passive) 표적화와 능동적 active) 표적화라는 두 가지 주요 전략을 통해 표적화를 최적화하는 데 활용될 수 있습니다.
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Passive Targeting : 이 방법은 LNP 의 크기, 제타 전위 및 기타 특성과 같은 물리화학적 속성을 최적화하여 특정 조직이나 세포로 유도하는 데 중점을 둡니다.
미세유체기술은 제형 조건을 조절하는 것만으로 이러한 나노입자 특성을 미세 조정할 수 있도록 돕습니다. |
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Active Targeting : Active targeting 은 리간드, 펩타이드 또는 기타 분자로 LNP 를 변형하여 조직 또는 장기 특이성을 강화하고 간 청소 (liver clearance) 를 피함으로써
생체 내 분포 (biodistribution) 및 전반적인 효능을 향상시키는 것을 포함합니다. 이 접근법은 치료제를 신체 내 원하는 부위에 더 정밀하게 표적화할 수 있도록 합니다. |
LNPs and CRISPR-Cas9 : A Promising Duo
Arezoo Mohammadian Farsani 연구진이 작성한 논문 Lipid Nanoparticles : The Game-Changer in CRISPR-Cas9 Genome Editing 에 수록된 연구들은,
변형된 LNP를 통해 Ribo-nuclear Protein 을 캡슐화하여 표적 세포로 전달하는 것이 효율적인 유전체 편집을 가능하게 하며, 청력 회복과 같은 유망한 in vivo 적용 가능성을 보여준다고 설명합니다.
하지만 Cas9 의 크기가 크고 denaturation 이 잘 일어나는 경향이 있다는 제약이 있습니다. 그럼에도 불구하고 특정 조직을 더 정밀하게 표적화하도록 개선된 LNP 제형들이 개발되었습니다.
CRISPR RNA 전달의 특이성을 높이고 표적 외 효과 (off-target effects 를 줄이기 위해 최근 연구들은 선택적 세포 표적화 기능을 가진 생분해성 biodegradable LNP 설계에 집중하고 있습니다.
예를 들어, 이온화 가능한 지질의 소수성 꼬리에 disulfide bonds 를 도입하면 endosome escape 과 Cas9 mRNA 의 세포 내 방출이 촉진된다는 것이 입증되었습니다.
Working principle of CRISPR-Cas9 delivery with LNP
Recent advancement in CRISPR/Cas9 delivery :: Ongoing Research
유전자 편집을 위한 Cas9 mRNA 전달 연구가 활발히 진행되고 있으며, 특히 Cas9 mRNA 와 가이드 RNA (gRNA) 를 단일 입자에 함께 캡슐화하거나 각각 별도로 캡슐화할 수 있는
LNP 를 통한 전달에 주목하고 있습니다. 동시 캡슐화 (co-encapsulation) 방식이 두 RNA 간의 비율을 더 잘 맞춰 유전체 편집에 결정적인 역할을 하므로 더욱 효과적인 것으로 보입니다.
예를 들어, Liu 등은 생체 내외에서 빠르고 효율적인 편집을 위해 생체 환원성 이온화 지질 BAMEA-O16B 를 포함하는 LNP 제형을 사용했으며, 최소한의 부작용으로 세포와 생쥐에서
표적 단백질 발현을 감소시켰습니다. LNP는 또한 PCSK9 유전자를 표적하는 것과 같은 염기 편집기 (base editors) 를 전달하는 데도 사용되어, 낮은 독성으로 생쥐와 마카크의 간에서
정밀한 유전체 편집을 성공적으로 유도했습니다.
양이온성 지질을 사용한 연구에서는 인간 일차 간세포에서 유전자 편집을 시연하여 영장류의 LDL 콜레스테롤 수치를 효과적으로 낮추었으며, 이는 임상 적용을 위한 LNP의 효능을 입증했습니다.
다른 연구들은 암에서의 유전자 편집에 초점을 맞추고 있습니다. 예를 들어, Finn 등은 Cas9 전달을 위한 LNP-INT01 제형을 개발하여 생쥐에서 Ttr 유전자의 지속적인 변형을 보여주었으며,
반복 투여를 통해 유전자 편집을 정밀하게 제어할 수 있음을 확인했습니다. Qiu 등은 LNP 를 사용하여 ANGPTL3 유전자를 표적하여 콜레스테롤과 중성지방 수치를 유의미한 독성 없이 감소시켰습니다.
한편, SORT 지질과 같은 변형된 LNP 시스템은 폐와 비장 같은 특정 장기를 표적할 수 있게 하여 선택적 유전자 편집의 가능성을 열었습니다.
추가 연구에 따르면 암세포를 표적하는 LNP 는 HPV18E6 와 같은 특정 유전자를 변형하여 종양 성장을 늦출 수 있음이 밝혀졌습니다. 마지막으로, 근육 내 전달을 위해 변형된 LNP 시스템은
뒤센 근이영양증 모델에서 효과적이고 반복 가능한 유전자 편집을 통해 유망한 결과를 보였습니다.
따라서 유전자 치료를 위한 LNP 의 사용은 현재 연구의 최전선에 있습니다. 한 예로 Beam Therapeutics 는 LNP 를 사용하여 자사의 염기 편집기를 직접 in vivo 로 전달하는 연구를 진행하고 있습니다.
이 편집기는 Cas9 와 유사하게 변형된 CRISPR 단백질을 사용하여 염기를 하나하나 다시 써서 유전체를 교정하며 정밀한 표적화를 가능하게 합니다.
CRISPR은 탈아미노효소 (deaminase) 를 서열에 전달하여 표적 염기를 화학적으로 변형시킵니다. 이 기술 또한 새로운 치료 프로그램에 매우 유망합니다.
Recent advancement in CRISPR/Cas9 delivery :: Clinical Trials
CRISPR/Cas9 에 LNP 를 활용한 첫 임상시험은 2020년 Intellia Therapeutics 가 유전성 Transthyretin Amyloidosis (ATTRv-PN) 치료를 위해 TTR 유전자를 표적하면서 시작했습니다.
초기 결과는 매우 유망했으며, TTR 단백질 수치가 크게 감소하여 in vivo CRISPR 치료의 주요 이정표를 세웠습니다.
2021년, 인텔리아는 유전성 혈관 부종 (HAE) 치료를 위해 KLKB1 유전자를 표적하는 두 번째 임상시험으로 임상 노력을 확대했습니다. 동물 모델에서의 전임상 연구는 고무적인 결과를 보여주어
인간 치료 성공에 대한 높은 기대를 낳았습니다.
2024년, Beam Therapeutics 는 알파-1 항트립신 결핍증 (AATD) 치료를 목표로 하는 새로운 염기 편집기인 BEAM-302 의 임상시험을 시작했습니다. 이 새로운 임상시험은 CRISPR/Cas9 뿐만 아니라
염기 편집기와 같은 차세대 유전체 편집 기술을 전달하는 LNP 의 성장하는 잠재력을 보여줍니다.
이러한 노력들은 CRISPR 기반 유전자 치료를 위한 LNP의 다재다능함과 효과를 강조하며, 제형 기술의 발전이 특이성, 안전성 및 치료 결과를 향상시키고 있음을 보여줍니다.
LNP는 유전체 편집 혁신을 전임상 연구에서 임상 실습으로 전환하는 데 핵심적인 도구가 되었습니다.
Conclusion on using LNP for CRISPR/Cas9 Delivery
생명공학 분야, 특히 CRISPR-Cas9 기술의 최근 발전은 유전체 편집을 혁신하여 유전자 치료, 기초 연구, 맞춤 의학 분야에서 새로운 가능성을 열었습니다. 그러나 CRISPR-Cas9 구성 요소를
특정 세포에 효율적이고 정밀하게 전달하는 것은 여전히 중요한 과제로 남아 있습니다.
이러한 맥락에서 LNP 는 핵산 분해로부터 보호하고 표적 전달을 가능하게 하여 표적 외 효과 (off-target effects) 를 최소화하는 유망한 해결책으로 부상했습니다.
이미 mRNA 전달에 성공적으로 사용된 LNP 는 핵산을 캡슐화하고, 체내 순환 시간을 연장하며, 세포 내 방출을 최적화함으로써 CRISPR-Cas9 시스템의 효율성을 높입니다.
LNP 의 정밀한 설계, 낮은 면역 반응 가능성, 그리고 효율적인 표적화 능력은 LNP 가 CRISPR 의 임상 적용을 위한 전달 방법으로 점점 더 선호되게 만듭니다.
전반적으로 LNP를 유전체 편집 접근 방식에 통합하는 것은 특히 표적 치료 및 유망한 임상 시험을 위한 방대한 기회를 열어줍니다.
이 기술의 지속적인 최적화는 다양한 유전 질환의 치료법을 혁신하고 정밀 의학의 발전에 기여할 수 있습니다.
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