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TAMARA 와 Ignite, 두 Microfluidic System 의 RNA-LNP Formulation 성능 비교 테스트 |
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Introduction
RNA-loaded Lipid Nanoparticle (RNA-LNP) 의 효율적인 제형화 (formulation) 는 mRNA 기반 백신 및 치료제 개발의 핵심 요소입니다.
이러한 Microfluidic-based system 은, 특히 탐색 단계에서 값비싼 시약을 최소한으로 사용하면서도 나노입자의 주요 특성 (크기, 균질성, 탑재 효율 등) 을 정밀하게 제어할 수 있기 때문에
RNA-LNP formulation 의 선도 기술로 자리잡고 있습니다.
이번 테스트에서는 1 mL 미만의 소량 부피에서 RNA-LNP Formulation 을 수행할 수 있는 주요 두 가지 Microfluidic Platform (TAMARA (Inside Therapeutics) 와 Ignite (Precision Nanosystems / Cytiva)) 의
성능을 비교했습니다. 평가 대상은 표준 mRNA-LNP 프로토콜을 이용한 제형 성능으로, 입자 크기, 탑재 효율 (encapsulation efficiency), 수율 (yield), 전사 효율 (transcription/delivery efficiency),
세포 생존율 (cell viability), 단백질 발현 (protein expression) 등 중요한 요소들을 포함했습니다.
연구의 목표는 전임상 (preclinical) 애플리케이션을 위해 어떤 플랫폼이 RNA-LNP 제형을 최적화하는 데 더 적합한지 결정하는 데 있습니다
Influence of Formulation Parameters on Size & PDI
아래 그래프는 TFR (Total Flow Rate, 총유량) 과 FRR (Flow Rate Ratio, 수상과 유상의 Flow Rate 비율) 이 TAMARA 와 Ignite 장비에서 생성되는 RNA-LNP 의
Z-average (입자평균크기, 파란색 막대) 와 PDI (Polydispersity Index, 다분산지수, 주황색 원) 에 어느 정도 영향을 미치는지 관찰하였습니다.
그래프 가로에서 TAMARA 는 TAM, FRR-TFR, Volume (in μL) 으로 표시되었고
Ignite 는 IGNITE, Batch Number (using DOE), Volume (in μL) 으로 표시되었습니다.
위 대이터에서 우리는 다음과 같은 결과를 알 수 있습니다.
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두 시스템 모두 샘플의 총유량 (TFR) 이 증가할 수록 생성되는 Nano Particle 의 크기는 작아졌습니다.
이에 반해 수상과 유상의 Flow Rate 비율인 FRR 은 나노입자 크기에 미치는 영향이 작았습니다 |
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두 시스템 모두 입자크기는 이상적인 크기 범위내에 있었으며 입자크기의 균일도 (PDI) 역시 산업표준 범위안에 있었습니다. |
Comparison of Encapsulation Efficiency (EE%) and Encapsulation Yield (EY%)
아래 그래프는 TFR (Total Flow Rate) 과 FRR (Flow Rate Ratio) 이 Encapsulation Efficiency (EE%) 과 Encapsulation Yield (EY%) 에 어느 정도 영향을 미치는 지 설명하고 있습니다.
여기서 Encapsulation Efficiency (EE%) 는 투입된 RNA 중에 몇 % 가 LNP 에 Trap 되었는가를 나타내고
Encapsulation Yield (EY%) 는 투입된 RNA 중에 세척, 여과 등의 공정을 거친 LNP 에 남아있는 RNA % 를 의미합니다.
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TAMARA 시스템은 700μL 와 400μL 샘플용량에서 모두 95% 이상의 encapsulation efficiency 를 보였습니다. |
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Encapsulation yield 의 경우 하나의 샘플 (TAM 4-9 700) 만 제외하고 700μL 모두 95% 이상의 효율을 보였습니다. |
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TAMARA, Ignite 모두 비슷한 EE% 를 보였습니다. |
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그러나 Encapsulation Yield (EY%) 의 경우TAMARA 가 Ignite 에 비해 훨씬 높은 EY% 를 나타내었습니다. |
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이는 Ignite 에 비해 TAMARA 의 RNA 회수율이 훨씬 높다는 것을 의미합니다. |
Comparison of Transcription Efficiency, Cell Viability, and Protein Expression
아래 그래프는 TFR (Total Flow Rate) 과 FRR (Flow Rate Ratio) 이 Transcription Efficiency, Cell Viability 그리고 Protein Expression 에 어느 정도 영향을 미치는 지 설명하고 있습니다.
여기서 GeoMFI (Geometric Mean Fluorescence Intensity) 로서 단백질 발현량이나 세포 표면 마커의 발현 세기를 나타내는 형광값으로서 수치가 높으면 Protein Expression 이 잘되고 있다는 것을 의미합니다.
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TAMARA 에 의해 제조된 모든 샘플의 Transfection efficiency 는 거의 100% 를 유지하였습니다. |
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700 μL 샘플은 세포생존율이 높으나 약간의 세포독성을 보이고 있으므로 샘플 volume 을 작게 하는 것이 좋을 것으로 판단됩니다. |
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Protein expression 은 formulation parameter 에 따라 약간의 변동은 있으나 전체적으로 단백질 발현이 잘 되고 있는 것으로 보입니다.
그리고 Encapsulation Yield 결과와 비슷하게 나오고 있습니다. |
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두 시스템 모두 90% 이상의 Transfection Efficiency (EE%) 을 보입니다. |
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두 시스템 모두 비슷한 Cytotoxicity 를 보이고 있습니다. |
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TAMARA 시스템은 Ignite 시스템에 비해 30% 더 좋은 protein expression 효율을 나타내고 있습니다. |
Conclusion
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Size & PDI :TAMARA 와 Ignite 모두 RNA-LNP 입자의 크기와 균일도가 Industrial Standard 에 적합합니다. |
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EE% & EY% :두 시스템 모두 Encapsulation efficiency (EE%) 가 유사하나 700 μL volume 의 샘플에서 TAMARA 가 90% 이상으로 나오는 반면
Ignite 는 75% 에 머물고 있습니다. |
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In cell studies : 두 시스템 모두 100% 에 가까운 transcription efficiency 와 낮은 cytotoxicity 를 보이고 있으나, protein expression 에 있어 TAMARA 의 효율이 약 30% 정도 더 좋았습니다. |
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RNA Usage : TAMARA 의 경우 400 μL 샘플의 결과가 Ignite 의 700 μL 샘플의 결과와 유사하므로 비싼 시약의 사용을 거의 반으로 줄일 수 있습니다. |
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Cost-effectiveness : 이 실험을 위해 TAMARA 는 단 두개의 Chip 을 사용하였으므로 Ignite 에 비해 실험 비용을 매우 절약할 수 있습니다. |
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Scalability : TAMARA 는 400 μL 에서 30 mL 까지 넓은 범위의 샘플을 동일한 성능으로 처리가 가능합니다. |
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