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Introduction
지질 이중층으로 구성된 구형 소포인 리포솜은 다양한 과학 및 의학 분야에서 다재다능하고 필수적인 도구로 떠올랐습니다 (Figure 1).
이들의 독특한 구조는 친수성 및 친유성 화합물의 캡슐화를 가능하게 하여 약물 전달 시스템, 화장품 및 진단 응용 분야에 이상적인 후보가 됩니다.
특정 물질을 캡슐화하고, 방출과정을 제어하며, 생체 이용률을 향상시키는 리포솜의 능력은 리포솜을 제약 연구 및 임상 실습의 핵심 구성 요소로 만들었습니다.
수많은 장점에도 불구하고, 전통적인 리포솜 합성 방법은 몇 가지 어려움을 가지고 있습니다. 전통적인 기술들은 대부분 batch process 로 진행되는데
이 때 크기 분포에 대한 조절이 매우 어려워 배치와 배치간 제품, 특성 등에 있어서 편차가 심하게 존재합니다. 이를 해결하기 위해 물질을 Homogenization 을 하게 되면
Encapsulation Efficiency 가 떨어지고 물질에 손상을 야기할 수도 있습니다. 그러므로 전통적인 Liposome 제조 방법이 가지고 있는 이러한 문제들을 해결하기 위한
혁신적인 기술이 필요합니다.
최근 몇 년 동안 미세유체 플랫폼 (microfluidic platform) 은 Liposome 합성을 위한 유망한 대안으로 부상했습니다. 마이크로채널 내 미세유체에 대한 정밀 제어는
lipid 와 캡슐화된 화합물의 균일한 mixing 을 가능하게 하여, 제어된 크기 및 특성을 가진 고도로 균일하게 분산된 Liposome 제조를 가능하게 합니다.
미세유체적 접근 방식은 확장성, 재현성 및 입자 크기 분포와 관련된 문제를 해결하며, Liposome 생산을 위한 보다 견고하고 효율적인 솔루션을 제공합니다.
Figure 1. Various types of organic nanoparticles. Liposomes are part of lipid-based nanoparticles,
as are the lipid nanoparticles. These particles differ mainly in their composition and internal structure, with lipo-somes having a double phospholipidic membrane.
이러한 맥락에서 우리는 리포좀 합성을 혁신하기 위해 설계된 획기적인 microfluidic mixing platform 인 TAMARA 를 소개합니다 (Figure 2).
TAMARA 의 탁월한 성능을 바탕으로, 연구자와 제조업체는 다양한 특성을 가진 Liposome 개발을 위한 정밀 제어가 가능하게 되어, 약물 전달, 진단 및 화장품 formulation 의 발전을 위한 길을 열 수 있습니다.
이 Application Note 에서는 TAMARA 의 작동 원리를 자세히 살펴보고, 기존 Liposome 제조 방법과 관련된 어려움을 극복하는 데 있어서 TAMARA 의 효능을 소개할 것입니다.
우리는 상세한 실험과 분석을 통해 Liposome 합성에서 TAMARA 의 뛰어난 성능과 다양성을 입증하고, 정밀하게 설계된 Liposome 기술의 미래를 엿볼 수 있도록 하는 것을 목표로 합니다.
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Figure 2. The TAMARA platform |
How does Liposome Synthesis work?
Figure 3. Importance of the mixing time on liposome synthesis.
Self-Assembly 에 의한 Liposome 합성의 근본적인 원리는 두 가지 miscible phases (유기용매 내 lipid 와 aqueous buffer) 의 빠른 혼합 (mixing) 에 달려 있습니다.
이는 lipid 의 용해도 감소로 이어지고, 지질은 나노입자를 형성하기 위해 뭉치기 (agglomeration) 시작합니다 (Figure 3).
Figure 3 에 나와 있듯이, mixing speed 는 합성된 나노입자의 크기에 큰 영향을 미칩니다. 혼합 (mixing) 이 빠를수록 나노입자의 크기는 작아집니다.
또한, 혼합이 효율적이고 균일할수록 크기와 분포에 대한 제어가 더 우수해집니다.
따라서 공정 전반에 걸쳐 균일하고 일정한 mixing time 확보하는 것이 최종 나노입자 크기 제어 및 균일성을 최적화하는 데 매우 중요합니다.
이러한 맥락에서 microfluidics 는 laminar flow (층류) 조건을 유지하는 독특한 능력 덕분에 이상적인 해결책이 됩니다.
이는 최종 나노입자의 물리화학적 매개변수를 최적으로 제어하기 위한 혼합 조건의 뛰어난 재현성을 가능하게 합니다.
Physico-chemical characterization of liposomes
Nanoparticle 의 크기는 stability, encapsulation efficiency, biodistribution, 그리고 cellular uptake 에 영향을 미치는 핵심 품질 속성(CQA, critical quality attribute) 이라 할 수 있습니다.
나노입자가 세포 내로 들어가는 Endocytosis 과정은 크기에 따라 크게 달라지며, 최적의 크기는 운반할 물질, 표적 세포, 실험 모델 (시험관 내, 쥐, 영장류 등) 과 같은 요인에 따라 달라집니다.
일반적으로 지질 나노입자(Lipid Nanoparticle) 는 60~120nm 범위에 속하며, 지나치게 큰 입자 (>200nm) 와 관련된 간 청소 및 신장 여과 문제,
그리고 지나치게 작은 입자와 관련된 독성 우려를 피할 수 있습니다. TAMARA 는 나노입자 크기를 정밀하게 제어하는 독특한 기능을 도입하여 약물 방출 효율 (drug release efficiency) 의
정밀한 최적화를 가능하게 합니다.
나노입자의 크기는 두 가지 방식으로 정의될 수 있습니다. Hydrodynamic Diameter 는 주로 동적 광산란 (DLS, Dynamic Light Scattering) 을 통해 측정되며,
Core Diameter 는 일반적으로 극저온 투과 전자 현미경 (Cryo-TEM) 으로 평가됩니다.
다분산 지수 (PDI, Polydispersity Index) 는 나노입자의 비균일성 정도를 나타내는 중요한 매개변수입니다. 이는 약물 전달 효율과 독성 모두에 영향을 미칩니다.
PDI 는 (표준편차/평균크기, Standard deviation/mean size)² 으로 표현되며, PDI 값이 낮을수록 입도분포가 더 균일한 (monodisperse) 입자들로 받아들여 집니다.
미국 식품의약국 (FDA) 가이드라인은 Lipsome 약물 제품의 경우 PDI 를 0.3 미만으로 유지할 것을 권장하지만, 더 작은 값이 선호됩니다.
첨단 microfluidics technology 를 기반으로 하는 TAMARA 는 formulation 내에서 뛰어난 PDI level 을 유지하며, siRNA-LNP 의 경우 일반적으로 약 0.1 의 값을 보입니다.
Figure 4. Dynamic light scattering working principle. Particles in suspension undergoing Brownian motion interact
with the laser beam and from the scattered light we can extract the diffusion coefficient and hy-drodynamic diameter of the particles.
동적 광산란(DLS) 은 Liposome 의 크기를 확인하는 데 가장 널리 사용되는 기술입니다. 이 기술은 현탁액 내에서 브라운 운동을 하는 입자들이 레이저 빛을 산란시키면서 발생하는 변동을
측정하는 원리로 작동합니다. 이러한 변동의 속도는 입자의 크기와 관련이 있어, Liposome 의 Hydrodynamic Diameter 을 결정할 수 있습니다 (Figure 4).
DLS 의 주요 장점 중 하나는 넓은 범위의 나노입자 크기를 빠르게 확인할 수 있어, Liposome 현탁액을 분석하는 데 효과적인 도구입니다.
여러 연구에서 Liposome 의 크기 측정에 있어 DLS 의 유용성과 효과를 강조했습니다. 예를 들어, Surianarayanan 등 (2016) 은 신뢰할 수 있는 결과를 얻기 위해 DLS 측정 시 Liposome 농도의
중요성을 강조했습니다. 이 연구는 Liposome 희석과 같은 요인이 DLS에서 특성화 결과에 어떻게 영향을 미칠 수 있는지를 이해하는 것의 중요성을 보여줍니다.
Liposomes synthesis with the TAMARA platform
Lipid Mixture 는 Phosphatidyl Choline (Lipoid S100, Lipoid Gmbh) 과 Cholesterol (Sigma-Aldrich) 을 각각 2:1 의 질량비로 구성했습니다.
60 mg/mL 의 Lipoid : Chol 원액은 각 지질 분말을 정밀하게 측정한 후 absolute ethanol 에 resuspension 시키고 초음파 처리를 통해 모든 지질을 용해시켜 준비했습니다.
작업 용액은 원액을 희석하여 10 mg/mL 로 만들었으며 Aqueous Phase 로는 Demineralized Water 를 사용하였습니다.
합성은 TAMARA 플랫폼을 이용하여 실온에서 진행하였습니다. 간략하게 설명하면, Controller Unit 에서 합성 조건을 선택한 후, 각 시약을 재사용 가능한 Reservoirs 에 Pipet 으로 주입했습니다.
합성 후 몇 초 뒤, 생성된 Liposome 샘플을 회수하여 측정 전까지 4°C 에 보관했습니다. 모든 샘플은 Deionized Water 로 20 배 희석한 후 DLS 방식으로 입도를 측정하였습니다.
Figure 5. Liposomes synthesis and characterization. Liposomes prepared with TAMARA and stored at 4°C until further use.
The 20x diluted sample was then measured with Particle Size Analyser to obtain the size distribution
Batch-to-batch repeatability analysis
이 실험에서 합성 조건은 유량비 3:1, 총 유량 4 mL/min 으로 일정하게 유지되었습니다. 이 과정은 다양한 최종 목표 부피 (0.25, 1, 10 mL) 에서 세번씩 반복하였습니다.
본 연구 동안 하나의 칩을 사용했으며, 각 실행 사이에 세심한 세척 단계를 수행했습니다.
우리는 목표 부피와 관계없이 모든 반복 실험에서 뛰어난 재현성을 확인했습니다 (Figure 6). 0.25, 1, 10 mL 에서 크기의 상대 표준 편차는 각각 6.5%, 5.5%, 2.5% 로 나타났습니다. |
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Figure 6. Batch-to-batch repeatability analysis for liposomes produced with the herringbone mixer channel
in the TAMARA platform. (A) Size and PDI obtained in 3 consecutive runs at different target volumes. (B) Correlograms and (C) size distributions highlight the monodispersity
and repeatability at 1 mL target volume.
이는 최대 약 4 nm의 크기 편차에 해당합니다. DLS 측정의 최대 재현성이 5%라는 점을 고려할 때, 배치 간의 이러한 크기 차이는 낮거나 무시할 수 있는 수준입니다.
모든 샘플은 균질했으며, 250 μL 에서는 PDI (다분산 지수) 가 0.3 미만이었고, 다른 모든 경우에는 0.2 미만이었습니다. 더 적은 부피에서 PDI 가 더 높게 나타나는 현상은 샘플의
'Head & Tail 현상' 즉 투입하는 샘플의 처음과 마지막 부분에서는 mixing 조건이 최적으로 유지되지 않기 때문에 나타나는 현상으로 설명할 수 있습니다.
Real-time Dynamic Light Scattering monitoring
샘플의 입도를 실시간 측정 가능한 DLS 입도분석장비를 이용하여 샘플의 입도를 측정하였으며 Liposome 의 입자크기는 약 80 - 90 nm 그리고 PDI 는 약 0.2 이하의 결과를 구하였습니다.
48 - 65 초 되는 시점에 비정상적 측정 값이 나타났는데 이는 비청정 환경 실험실에서 흔히 발생하는 먼지등에 의한 것으로 판단됩니다.
Figure 7. Real-time size measurement with DLS instrument. Size and PDI calculated periodically over periods of 3 seconds.
Unwanted event (dust) occuring between 48 and 65 seconds is visible on the intensity recording
Conclusion
결론적으로, TAMARA microfluidic platform 은 Lipsome 합성 과정을 획기적으로 개선하며, Lipsome 의 크기와 특성에 대한 높은 수준의 제어 능력을 제공한다는 것을 알 수 있습니다.
이러한 발전은 기존 Lipsome 생산 방식의 한계를 크게 해결할 수 있을 것으로 기대됩니다.
TAMARA 의 주요 이점 중 하나는 최적의 다분산 지수 (PDI) 를 가진 Lipsome 을 일관되게 생산할 수 있는 능력을 가지고 있다는 것인데 이는 TAMARA 를 이용해 생산한 Liposome 크기가
매우 균일하다는 것을 의미하는데 이는 약물 전달 시스템의 효능과 안전성에 매우 중요한 역할을 합니다. |
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