SOLUTION TO TERMINAL STERILIZATION OF NANOEMULSION ADJUVANTS
Nanoemulsion은 drug delivery system으로서 중요한 장점을 제공한다는 것이 입증되었습니다.
생분해성 oil-in-water emulsion은 효과적인 vaccine adjuvants (백신 면역증강제/보조제)의 기반이 됩니다.
왜냐하면 o/w emulsion은 내성을 향상시키고 추가적인 면역 자극없이 면역반응의 증가를 보였기 때문입니다.
대부분의 adjuvanted vaccines은 주사로 환자에게 투여되는데, 이는 멸균이 매우 중요한 단계가 됨을 의미합니다.
열에 불안정한 물질이 있는 시스템의 경우, 열을 사용한 최종 멸균은 가능한 옵션이 될 수 없기 때문에 이를 대신하여
sterile filter (멸균 필터)를 사용하게 됩니다.
Sterile filter 단계의 검증은 어려울 수 있으므로, 공정 개발과 필터 기술이 결합된 강력한 솔루션이 요구될 수 있습니다.
Sterile filters는 220nm 등급의 sterilizing-grade filters에 제품을 통과 시키게 되는데, 220nm보다 큰 입자는 filter 처리량을 크게
감소시키거나 filter를 막히게 할 수 있습니다. 따라서 제조 과정에서 크기가 작은 입자와 좁은 입자 크기 분포를 갖는
adjuvant nanoemulsion을 생산해야 할 필요가 있습니다.
둘째로, 제조 과정과 환경에서 유입된 다양한 오염원은 sterile filter 단계에 또 다른 어려움을 줄 수 있습니다.
마지막으로 adjuvant nanoemulsion의 성질은 박테리아 보유 효율의 감소와 생산물의 무균 상태를 잃을 수 있는 고위험성
유체를 만들 수 있습니다.
이 블로그에서 우리는 nanoemulsion 기반 adjuvant의 생산 방법과 성공적인 sterile filter 과정에 대해 논의하고자 합니다.
Sterile Filtration
만약 제품이 aseptic (무균) 환경에서 가공되지 않는다면 (비싸고 관리가 어려움), 박테리아를 포함한 오염물질이 제조과정과
유지기간 동안 다양한 외부 경로로 유입될 수 있습니다.
이를 방지하고자, sterilizing grade filter를 이러한 오염물질을 제거하기 위해 사용할 수 있다. 2004년 Sterile Drug Products
Produced by Aseptic Processing 에 대한 US FDA’s Guidance에 따르면 sterilizing grade filter는 ‘적합하게 검증된 filter는
모든 미생물을 유체 흐름으로부터 제거할 것이며 sterile 액체를 생산할 것이다’라고 정의되어 있습니다.
이러한 filter는 일반적으로 0.22 μm의 pore 지름을 가지고 있습니다. 이것은 이러한 filter가 0.22 μm pore 크기를 가지는 것으로
되어 있지만 실제 membrane은 0.22 μm보다 더 큰 pore가 많기 때문에 박테리아가 membrane의 어느 정도 깊이까지는 침투할 수 있습니다.
동일한 guidance는 sterile filter의 유효성 검증에 대해서도 ‘부적절한 생산 조건에서 생산된 filtering 될 물질에 대한 미생물학적 실험과
연구에 사용되는 filter의 무결점 테스트가 포함되어야 한다’고 지적하고 있습니다. 일반적으로 사용되는 미생물은 Brevundimonas
diminuta 로 적어도 107 CFU per cm2 of effective filtration area의 농도로 사용됩니다. 또한 일반적으로 emulsion이 일정한 박테리아
감소와 연속적인 박테리아 보유 연구를 달성하기 위해 사전 filter가 필요합니다.
Microfluidizer® Technology
Microfluidizer processors는 fixed geometry Interaction ChamberTM에 있는 microchannels을 통해서 multi-phase fluids를 pumping 하기
위해서 매우 높은 압력을 사용합니다. 고압에서 microchannel에 있는 유체의 속도는 400 m/s 보다 더 빠르며, 이를 통해 매우 큰 (108 s-1)
전단력을 발생합니다. 잇따른 turbulent 에너지에 의해 발생된 높은 전단력과 강력한 micro-mixing은 유의적이고 효과적으로 입자 크기를
줄일 수 있습니다. Microfluidizer processors를 사용하면 희망하는 입자 크기를 얻을 수 있을 뿐만 아니라 매우 좁은 입자 크기의 분포를
얻을 수 있습니다.
아래에 보이는 바와 같이, Microfluidizer 기술을 활용한 scale-up은 매우 간단합니다. Lab scale unit은 single microchannel Interaction
Chamber을 사용하며, production scale unit은 이러한 microchannels을 평행하게 추가 배치하여 동시에 많은 양을 처리할 수 있습니다.
이 때 모든 물질은 여전히 동일한 수준의 전단력을 받게 되기 때문에 보장된 scale-up 결과를 얻을 수 있습니다.
Case Study Methodology
이 사례 연구에서 vaccine adjuvant는 Microfluidizer processor를 사용해 생산된 후, Pall Life Sciences에서 제조한 sterilizing grade filter를
통과하였습니다. 전체 과정은 아래 도표에 설명되어 있습니다. Model adjuvant emulsion은 squalane oil로 구성되었습니다.
다른 입자 크기를 가진 nanoemulsions을 생성하기 위해 pilot scale Microfluidizer processor를 여러 조건으로 설정하여 배합을
처리하였습니다. nanoemulsion은 먼저 Pall Supor® EKV filter로 사전 filtering 되었으며 Pall Fluorodyne® EX EDF filter를 사용해
다시 filtering 되었습니다 (둘다 sterilizing grade filters). Filtering 액체는 process 검증을 위해 앞에서 언급한 bacterial retention study 를
따라 평가되었습니다.
Results
Vaccine Adjuvant Nanoemulsion Production
모든 다른 nonoemulsion models (다른 가공 조건에서 생산되어 다양한 크기의 입자를 갖는)은 다음과 같은 결과를 나타내었습니다.
측정된 결과는 Microfluidizer processor가 작은 입자 크기를 갖는 nanoemulsions을 생산하는데 매우 효과적일 뿐만 아니라 원하는
결과물을 얻기 위한 조절이 매우 쉽다는 것을 보여주었습니다. 모든 테스트는 d50 (중간 입자 크기)가 200nm 이하를 달성하였으며,
110 ~ 170nm 범위를 가졌습니다. d95 (상위 5%를 제외한 입자의 크기)는 180 ~ 300nm로 매우 좁게 분포하였습니다.
모든 nanoemulsion 샘플은 매우 좁은 입자 크기 분포를 나타내었습니다.
Sterile Filtration
Nanoemulsions의 d50이 155 nm (Sample A), 139 nm (Sample B), 124 nm (Sample D)인 샘플은 Pall Fluorodyne EX EDF filter을
통과시켰으며 결과는 다음과 같습니다.
각 샘플들의 d50은 그들이 0.22 μm filter를 통과할 수 있다는 것을 보여주었으며, 실제 측정된 처리량 (throughput)과 흐름 (flux)은
샘플 마다 다르게 나타났습니다. 124nm의 d50을 가진 nanoemulsion은 더 큰 d50을 가진 샘플들 보다 더 빠르게 filter를 통과하였으며
거의 20배 이상의 높은 처리량을 나타내었습니다. Sterile filter를 통해 효과적으로 샘플을 처리하기 위해서는 정확한 범위의 d50을
갖더라도 전체 입자의 분포가 고려되어야 한다는 것을 입증한 것이었습니다.
본 연구에서 높은 처리량은 낮은 d95 값과 직접적인 연관이 있었습니다.
실제적으로 작고 좁은 입자 크기 분포는 filter에 대한 비용을 크게 줄일 수 있다는 것을 의미할 수 있습니다. 큰 입자의 수가 적을수록
membrane pore에 잡힐 수 있는 입자가 적다는 것을 의미하므로 처리량을 늘리고 동시에 막히는 filter의 양을 줄일 수 있습니다.
결과적으로 더 작은 filter area 또는 적은 수의 filter는 같은 양의 제품을 처리하는데 요구될 것입니다.
이러한 입자 크기 결과는 Interaction ChamberTM, 압력, pass의 수를 포함한 정확한 처리 조건을 정확하게 선택하여
Microfluidizer processor를 사용할 때 얻을 수 있습니다.
본 연구에서 124 nm d50를 가진 nanoemulsion의 입자 크기는 filtration 전과 후 (30psi와 60psi 압력 하에 filtering)에 측정되었습니다.
아래 그림에서 볼 수 있는 것과 같이 filtration process 또는 선택된 filter membrane material은 입자 크기에 영향을 미치지 않았습니다.
d10, d50, d90 입자 크기는 30psi와 60psi에서 필터 된 것과 사전 filtration size와 다르지 않았습니다. 이 것은 nanoemulsion의 특성이
유의적으로 변하지 않았음을 의미합니다.
Bacterial Challenge Test
124 nm d50을 가진 nanoemulsion과 EDF filters가 bacterial challenge test를 위해 선택되었습니다.
이 것은 중요한 검증과정으로 nanoemulsion 또는 process 조건이 평가된 organism 또는 filter membrane에 영향을 주었는지를 결정하며,
test organism을 보존하지 못하게 합니다. 결과는 아래 표에 나와있습니다. 완벽하게 박테리아를 보존하는 filter은 평가된 모든 filtration
압력에서 filtering 액체에 박테리아가 하나도 없는 것을 나타냅니다. 이 것은 adjuvant nanoemulsions과 이들의 가공 과정에서
sterile filtration process가 성공적으로 검증되었음을 가리킵니다.
Summary
요약하면, 이 연구는 noaoemulsion 입자 크기와 분포는 Microfluidizer processor의 맞춰진 processing parameter에 의해 정확하게
통제될 수 있음을 보여주었습니다. 이와 같이 입자의 정확한 크기와 분포는 처리량과 filtering 능력의 손실 없이 sterile grade filter를
통한 효과적인 처리가 보장되기 위해 필요합니다.
추가적으로 효과적인 sterile filter는 입자 크기에 큰 영향을 주어서는 안되며 filter를 통과시킬 제품이 당신이 얻을 제품의 사양과 반드시
동일해야 제품의 품질을 확신할 수 있다는 것을 의미합니다.
Ref 1: US Food and Drug Administration. Guidance for industry. Sterile drug products produced by aseptic processing:
good manufacturing practice. Rockville, MD. Sep, 2004.
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LM20 Laboratory Microfluidizer
M815 Microfluidizer
M700 series Microfluidizer for production
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