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- Reference : AOAC 985.29 Total Dietary Fiber in Foods
- Tested with VELP Scientifica GDE Enzymatic Digester (Code F30400209) and CSF6
Filtration Unit (Code F30420210).
Protein determination was performed with DK 6 Kjeldahl Digestion Unit (Code F30100182) and
UDK 159 Automatic Kjeldahl Distillation & Titration System (Code F30200150) |
서 론
식이 섬유는 수용성 및 불용성 다당류 (올리고당, cutin, suberins, lignins) 와 같은 복잡한 유기 물질의 혼합물로서
사람의 위장에서 소화되지 않으며 포만감을 높이고 장 기능 개선의 효과가 있는 중요한 영양소이다.
콘플레이크 샘플에서 총 식이섬유 (Total Dietary Fiber, TDF) 함량분석
식이 섬유의 확인에는 효소법과 무게측정법을 함께 사용한다.
1. 샘플 : 건조시킨 fat-free 식품 두개를 샘플로 이용
2. 먼저 열에 안정한 α-아밀라아제로 처리하여 샘플을 젤라틴화
3. 다시 amyloglucosidase 로 처리하여 샘플에 있는 전분을 모두 가수분해
4. Protease 를 처리하여 샘플내 단백질을 제거.
5. 에탄올을 처리하여 수용성 식이섬유 (soluble dietary fiber) 를 침전
6. filter 를 이용하여 침전물을 여과
7. 에탄올 과 아세톤을 이용하여 washing
8. 여과/세척시킨 침전물을 건조한 후 무게 측정 (W1)
9. 두개의 샘플 중 하나는 분해되지 아니한 단백질의 양을 분석하는 실험을 하고 무게 측정 (W2)
다른 하나의 샘플은 고온에서 灰化(ashing) 시킨 후 무게를 측정한다 (W3).
※ 총 식이섬유 함량 = W1 - W2 -W3
필요장비
- 6 glass beakers 400 ml (code A00000999)
- Magnetic stirring bars, 6 x 35 mm (code A00001056)
- Pool balls (code A00000241)
- Fan oven
- Muffle furnace
- Desiccator
- Analytical balance 0.1 mg accuracy
- pH-meter standardized at pH 4.0 and 7.0
- Glass crucibles P2 (code A00000140)
- Automated Pipettor 1 ml, 100 μl, 200 μl
- Aluminum foils
필요시약
- Petroleum ether 40-60 ℃, analytical grade
- Ethanol 95 % v/v, Ethanol 78 % v/v - 207 ml of distilled water diluted to 1 L with
95 % ethanol.
Mix and if necessary, dilute again to volume with 95 % ethanol
- Acetone, analytical grade
- Phosphate buffer, 0.08 M, pH 6.0 - 1.400 g of sodium phosphate dibasic anhydrous
(Na2HPO4) and 8.400 g of sodium phosphate monobasic anhydrous (NaH2PO4)
dissolved in 1 L distilled water.
Check pH with pH-meter. Adjust to pH 6.0 if necessary using either sodium
hydroxide solution or phosphoric acid solution
- Alpha-amylase, heat-stable, solution
- Protease solution - 50 mg in 1 ml phosphate buffer
- Amyloglucosidase solution
- Sodium hydroxide solution, 1.0 N, analytical grade
- Sodium hydroxide solution 0.275 N - 275 ml of 1.0 N sodium hydroxide diluted to 1 L
with distilled water
- Hydrochloric acid solution, 1.0 N, analytical grade
- Hydrochloric acid solution 0.325 N - 325 ml of 1.0 N hydrochloric acid diluted to 1 L
with distilled water
- Celite, acid washed
Sample : 콘플레이크, Fiber labeled value: 3 %
Sample Preparation : 균질화한 샘플을 105 ° C, 24h 동안 건조하고,
데시케이터에서 냉각한 뒤,
0.3 - 0.5 mm 메쉬로 분류 및 분쇄하여 샘플을 준비한다.
Enzymatic Digestion and Filtration Procedure
1. 400 ml 비커에 들어있는 50ml 인산염완충액 (pH 6.0) 에 1g 의 샘플을 넣고 잘 섞은 후
여기에 magnetic stirring bar 를 넣는다.
2. 열안정성 α-아밀라아제 100 μl 를 첨가한 후 충분히 섞는다. 비커를 알루미늄 호일로 덮고
GDE 안에 비이커를 95-100 ℃, 30 분간 위치시킨다.
이 때 magnetic stirring 기능을 사용하여
95-100 ℃ 의 열이 비커 내부에 균일하게 전달되도록 한다.
3. 샘플이 담긴 비커를 꺼내 실온으로 냉각한다.
4. 알루미늄 호일을 제거하고 플라스크 내벽을 증류수 10 ml 로 헹군다.
그 후 0.275 N NaOH 용액 약 10 ml 를 사용하여 샘플의 pH 를 7.5 ± 0.2 로 조정한다.
5. GDE 의 온도를 60 ℃로 설정한다.
6. 비커에 프로테아제 용액 100 μl 를 넣고 알루미늄 호일을 덮는다.
GDE 에서 연속적으로 교반하면서 60 ℃, 30 분간 가열한다.
7. 실온으로 냉각한다.
그 후 0.325 N 염산 용액 약 10 ml 를 사용하여 pH 를 4.5 ± 0.2 로 조정한다.
8. 비커에 아밀로글루코시다제 용액 200 μl 를 넣고 GDE 에서 연속적으로 교반하면서
60 ℃, 30 분간 가열한다.
9. magnetic stirring bar 를 제거하고 60 ℃ 로 예열 된 95 % 에탄올 280 mL 를 넣는다.
그 후 실온에서 60 분간 침전물의 형성을 기다린다.
10. 유리 도가니에 약 1g 의 셀라이트를 넣고 5 시간 동안 550 ℃ 의 oven 에 넣고 0.1 mg 까지
변화가 없도록 냉각 및 칭량을 반복한다.
11. 셀라이트를 78 % EtOH 수 ml 를 사용하여 적신다.
12. 셀라이트가 담긴 도가니를 CSF 6 여과 장비에 설치한 후 진공을 가한다.
Funnel 을 사용하여 9번 과정까지 완료한 샘플을 도가니로 옮기고 여과를 시작한다.
13. 여과 후 도가니 잔유물을 78 % 에탄올, 95 % 에탄올, 아세톤 혼합액을 사용하여 헹군다.
14. drying oven 을 이용하여 105 ℃, 24 h 에서 건조시킨다. 그 후 0.1 mg 까지 변화가 없도록
냉각 및 칭량을 반복하여 잔류물의 양을 확인한다.
15. 잔류물 중 불용성 단백질 및 회분은 Kjeldahl 장치 및 회분 분석을 통해 확인하여 식이섬유의
양을 확인한다.
Typical Results
결론
이 테스트를 통해 GDE 와 CSF6 system 이 총 식이섬유 함량을 분석하는데 적합한 장비라는 것을 알 수 있으며
그 결과의 수치 역시 매우 정밀하고 신뢰성있는 값이라는 것을 알 수 있다.
GDE 와 CSF8 system 의 장점
1. 핵심적인 효소반응에서 매우 정밀한 온도조절이 가능
2. 디지털 타이머 내장 (GDE)
3. 6개의 샘플을 filteration 과 washing 하는데 20분이면 충분
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