PRODUCTION OF VACCINE ADJUVANTS USING HIGH SHEAR FLUID PROCESSING
전염병의 발병을 예방하고 생명을 구하는 가장 효과적인 방법은 백신을 사용하는 것입니다. 2세기 전 처음 백신이 소개된 이래로, 백신은 팬데믹을 예방하는 가장 효과적인 방법이 되었습니다.
Vaccine adjuvants 는 면역반응을 증대시켜 백신의 효능을 크게 향상 시키는 능력을 가지고 있어 사람과 가축 백신에서 가장 중요한 성분입니다.
지금도 폭 넓게 사용되고 있는 전통적인 adjuvants는 aluminum salts를 기반으로 합니다. 그 것은 체액성 (Th2) 면역 반응을 도입하므로 세포성 (Th1) 면역 반응에 더 효과적인 특정 백신에는
적합하지 않습니다. 안정한 nanoemulsions 을 사용한 새로운 adjuvants는 전통적인 adjuvants와 비교하였을 때 여러 장점을 가지고 있어서 더 나은 진보된 대안이 되었습니다.
- 추가적인 면역 촉진제 없이 면역 반응의 향상시킬 수 있는 능력
- 세포성 (Th1), 체액성 (Th2) 및 major histocompatibility complexes (MHC) 반응을 모두 효과적으로
향상 시킬 수 있는 능력
- 좋은 내성과 생분해성
Key Production Requirements & Challenges
Vaccine adjuvants 또는 delivery systems으로 nanoemulsion이 사용되는 여러 장점에도 불구하고, 제약 산업은 주요 제조 문제에 직면하고 있습니다:
(1) 입자 크기/ 크기 분포를 어떻게 정확하게 조절할 수 있는지, (2) 공정의 scalability와 repeatability를 어떻게 얻을 것인지, (3) cGMP 규정을 어떻게 충족할 것인지.
Nono-emulsions은 역학적으로 안정하지만 그들의 안정성은 주로 Ostwald ripening 현상 (emulsion의 polydispersity (size heterogeneity)와 입자 크기에 따른 용해도
차이에 의해 발생)에 의해 영향을 받습니다. 비경구 nanoemulsion은 투여를 위해 멸균이 필요합니다. 효과적이고 상대적으로 간단한 멸균방법은 220nm sterilizing-grade filters를
통한 filtration (terminal sterilization)입니다. 만약 220nm보다 큰 입자들이 많다면 filter의 처리량이 감소되는 원인이 되며 많은 filters가 필요하기 때문에 이는 filtration 비용의 증가를
의미합니다. Filter는 막힐 수 있으며 생산 손실로 비용이 발생할 수 있습니다. 그러므로 입자 크기와 크기 분포는 모두 매우 중요합니다.
How Microfluidizer Technology™ Support Vaccine Adjuvant Production
Microfluidizer technology 는 동급 최고의 nanoemulsion을 생산하기 위한 최적의 솔루션입니다. 아래 Figure 2와 3에서 볼 수 있듯이,
이 기술의 기반은 micro-channel로 구성된 fixed geometry Interaction Chamber™에 있습니다. Interaction Chamber 내부의 flow는 큰 turbulent가 일어나며 fluid는 매우
강력한 전단력 (108 s-1)에 노출됩니다. 이 전단력 크기는 원하는 수준의 micro mixing에 도달하기 위해 필요한 다른 비교될만한 technologies보다 훨신 큰 것입니다.
또한, Microchannel은 조절가능한 전단력을 공급하기 위한 모양과 크기를 가지고 있습니다. Constant pressure pumping technology는 단단한 고밀도, 고점도, 넓은 범위의
온도를 가지고 있는 물질들에도 적용가능하고 batch mode 또는 continuous mode로 모두 작동 가능합니다. 제품 온도는 heat exchanger와 같은 cooling devices를 통해 효과적으로
제어할 수 있습니다.
Figure 2: Schematic of Microfluidizer Processor
Single-Slotted Interaction Chamber and Multi-Slotted Interaction Chamber
Microfluidics는 2종의 다른 Interaction Chamber (IXC) designs을 제공합니다: Z type과 Y type. 아래 figure는 Y-IXC를 보여주고 있습니다. Z-IXC는 일반적으로 cell disruption과 dispersion에
사용됩니다. Y-IXC는 일반적으로 liquid-liquid emulsions, encapsulations, liposomes 생산에 사용됩니다.
Y-IXC로 nanoemulsion을 생산할 때 fluid는 inlet에서 두 흐름으로 나뉘어집니다. 각 흐름은 micro-channel을 통과하며 매우 높은 shear (전단력)을 만나고 high impact zone에서 충격을
받게되어, 높은 turbulent energy에 의해 micro mixing이 생성됩니다. Shear와 micro mixing은 입자가 nanometer 수준으로 쪼개어지도록 합니다. 아래 그림의 오른쪽에 보이는
Multi-slotted scale-up IXC design은 10L/min 수준으로 처리량을 증가시킬 때 linear scalability를 보장하기 위해 동일한 microchannel을 수평으로 나열하여 설계되었습니다.
이는 각 microchannel 내부의 fluids가 정확하게 동일한 shear rate로 처리되어 동일한 수준의 micro mixing이 가능하도록 합니다.
Figure 3: Schematic of Y-Type Interaction Chamber
Intensifier pump와 fixed geometry IXC의 조합은 Microfludizer processor의 매우 중요한 이점인 constant process pressure profile
(fluid를 처리하는 압력이 매우 일정함)을 제공합니다. 아래 그림에서 볼 수 있는 것과 같이 Microfluidizer processor의 처리 압력은 compression strokes를 위한 목표 압력에
대부분 도달하며 일정합니다. 이는 모든 제품이 Microfluidizer processor에서 목표 압력으로 처리된다는 것을 의미하는 매우 중요한 결과입니다.
처리된 결과로 작은 입자 크기와 좁은 입자 크기 분포를 갖는 nanoemulsion을 얻을 수 있습니다. 최종 생산품의 품질은 suction stroke (zero-pressure 부분)의 영향을
받지 않습니다. 왜냐하면 그 시점에서는 어떠한 물질도 push되거나 IXC에서 처리되지 않기 때문입니다. 반면 전통적인 High Pressure Homogenizers (HPH)은 압력이
아닌 부피가 일정하도록 설계되어있습니다. 그러므로 HPH의 일반적인 pressure profile은 전체 cycle에서 매우 다양하게 나타나며 목표 압력보다 50% 이상 감소되기도 합니다
(Figure 4의 red profile). 이러한 큰 압력 편차로 인해 HPH로부터 얻은 emulsion은 일반적으로 큰 입자를 갖으며 넓은 입자 크기 분포를 보입니다.
Figure 4: Pressure Profile Comparison between Microfluidizer Processor and High Pressure Homogenizer
여기에서 설명하는 연구 사례는 nanoemulsion adjuvants의 생산에서 Microfluidizer technology 사용의 이점을 잘 보여주고 있습니다.
이 연구에서, Microfluidizer process는 model oil-in-water nanoemulsion adjuvant의 생산에 사용되었으며 전통적인 HPH technology에 의해 생산된 결과물과 비교되었습니다.
Model oil-in-water nanoemulsion은 squalane oil based emulsion이었습니다. 실험에 사용될 pre-emulsion을 만들기 위해, separate oil과 aqueous phase를 배합하고 이를
low energy rotor-stator mixer (Quadro HV0)로 mixing하였습니다. Final nanoemulsion은 Microfluidizer processor (M110P) 또는 HPH로 생산되었습니다.
각 processor에서 적용 압력과 pass 횟수를 다양하게 하여 처리하고 그 결과물을 평가하였습니다. 입자 크기와 입자 크기 분포는 dynamic light scattering instrument와 optical microscope를
사용하여 분석되었습니다.
RESULTS AND DISCUSSION
결과에서 Microfludizer processor는 HPH보다 매우 높은 효율과 재현 가능한 더 나은 결과를 보여 유의적으로 뛰어난 퍼포먼스를 하는 것으로 나타났습니다.
Efficiency
Figure 5는 Microfluidizer processor (MF)가 HPH보다 빠른 입자 크기 감소를 달성하였음을 보여줍니다. MF로 처리된 emulsion의 입자 크기는 10, 20, 30k psi의 처리 압력에서
모두 작은 것으로 나타났습니다. HPH를 고압으로 설정하여 5회 처리된 nanoemulsion의 평균 입자 크기는 MF의 낮은 압력 (10k psi)으로 처리하여 얻은 입자 (180nm)에도
미치지 못하는 수준이었습니다. 추가적으로 동일한 조건과 에너지 하에서 (같은 압력과 처리 횟수), MF로 가공된 nanoemulsion은 HPH로 가공된 것 보다 18-55% 더 입자가 작았습니다 (figure 6).
Figure 5: Average Size of Particle Nanoemulsions obtained with Microfluidizer Processor and High Pressure Homogenizer
Figure 6: Particle size increase of homogenized nanoemulsions comparing to Microfluidizer processor created nanoemulsions.
Unifomity
MF에 의해 생성된 nanoemulsion은 동일한 에너지를 사용해 HPH에 의해 생성된 것보다 polydispersion (size heterogeneity)의 정도가 17-91% 더 낮았습니다 (figure 7).
대부분의 테스트 조건에서, MF에 의해 생성된 nanoemulsion은 균일한 입자 크기 분포를 보였으며, polydispersity index (PDI)가 0.1보다 작았습니다. 반면 HPH로 생성된
nanoemulsion은 넓은 입자 크기 분포를 보이며 더 큰 PDI 값을 갖았습니다.
Figure 7: Polydispersity index of nanoemulsions obtained with Microfluidizer Processor and high pressure homogenizer
Power Consumption
Table 1은 MF와 HPH의 전력 소비를 비교하여 보여줍니다. 유사한 결과에 도달하기 위해서, HPH는 MF보다 7.5배 더 많은 전력을 소비하였습니다.
예로 180nm 정도의 입자 크기를 갖는 nanoemulsion을 얻기 위해서 emulsion은 30,000 psi 압력으로 설정된 HPH에서 5회 처리되어야 합니다.
반면 MF로 처리될 경우에는 10,000 psi 압력에서 2회만 처리되어도 같은 결과를 얻을 수 있습니다.
Table 1: Powder consumption between high pressure homogenizer and Microfluidizer Processor
Repeatability
Figure 8은 동일하게 30k psi 압력 하에서 각 방법으로 1회 처리하였으며 이를 3번 반복 실험하여여 얻은 nonoemulsion의 평균 입자 크기를 보여줍니다.
입자 크기의 표준 편차는 HPH에 의해 생산했을 때 (3.8-14.8)보다 MF에 의해 생산했을 때 (0.1-2.6) 훨씬 더 낮았습니다.
Figure 8: Repeatability in terms of particle size of homogenized nanoemulsions comparing to Microfluidizer processor created nanoemulsions.
IN CONCLUSION
Microfluidizer processor와 High Pressure Homogenizer 방법을 사용해 생산된 nanoemulsions을 비교한 사례에서 설명된 것과 같이, Microfluidizer technology는
nonoemulsion vaccine adjuvants의 제조에 최적화되어 있습니다.
입자 크기, 크기 분포, 전력 소비 및 가공 재현성을 분석한 결과는 모두 Microfluidizer 기술이 전통적인 HPH 기술보다 nanoemulsion을 생산하는데 더 효과적임을 보여주었습니다.
우수한 nanoemulsion 생산의 또 다른 이점은 향상된 분산 안정성과 더 효과적인 멸균 필터 처리가 가능하도록 하는 것입니다.
백신 개발에 사용되는 장비와 기술에 대한 더 많은 정보를 위해서 Microfluidics사의 resource page를 방문하실 수 있습니다.
REFERENCES
1. Vaccine adjuvants review, www.Innivogen.com, 2011
2. Subunit vaccine delivery, Springer, 2015
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LM20 Laboratory Microfluidizer
M815 Microfluidizer
M700 series Microfluidizer for production
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